کشت سلول چیست و چگونه انجام می شود؟

کشت سلول، به عنوان یک فناوری ارزشمند، بستری فراهم می‌آورد تا دانشمندان بتوانند به مطالعه دقیق فیزیولوژی و بیوشیمی سلول‌های سالم و بیمار بپردازند. در این روش، سلول‌ها در محیطی مصنوعی و تحت شرایط کنترل‌شده رشد می‌کنند. این سلول‌ها می‌توانند مستقیماً از یک موجود زنده (حیوان یا گیاه) استخراج شده و پس از فرآوری‌های لازم، کشت شوند یا از رده‌های سلولی از پیش آماده شده به دست آیند. شرایط کشت بسته به نوع سلول متفاوت است، اما در هر صورت، محیط کشت باید مواد مغذی ضروری (مانند اسیدهای آمینه، کربوهیدرات‌ها، ویتامین‌ها و مواد معدنی)، عوامل رشد و هورمون‌های لازم را برای سلول‌ها فراهم کند. همچنین، کنترل دقیق گازها (O2 و CO2) و شرایط فیزیکوشیمیایی (pH، فشار اسمزی و دما) برای رشد بهینه سلول‌ها در محیط مصنوعی ضروری است.

انواع کشت سلول

کشت سلول اولیه زمانی ایجاد می‌شود که سلول‌ها مستقیماً از بافت‌های حیوانی یا گیاهی جدا شده و در شرایط آزمایشگاهی رشد کنند. پس از ایجاد کشت اولیه، کشت‌های فرعی حاصل از آن، کشت سلول ثانویه را به وجود می‌آورند. این کشت‌های ثانویه، برخلاف رده‌های سلولی، توانایی تقسیم نامحدود ندارند. سلول‌های اولیه و کشت‌های فرعی آن‌ها، به دلیل پدیده پیری، طول عمر محدودی دارند. با این حال، تحت شرایط خاص، این کشت‌ها می‌توانند به رده‌های سلولی جاودانه تبدیل شوند. این تبدیل می‌تواند به صورت خودبه‌خودی یا با القای عوامل شیمیایی یا ویروسی رخ دهد. رده‌های سلولی جاودانه، قابلیت نگهداری و استفاده طولانی‌مدت در آزمایشگاه را دارند.

سلول‌های بنیادی، گروهی خاص از سلول‌ها هستند که توانایی خودنوسازی و تمایز به انواع مختلف سلولی را دارند. این ویژگی‌ها، سلول‌های بنیادی را به ابزاری ایده‌آل برای تحقیقات مختلف تبدیل کرده است.

تاریخچه کشت سلول

سیدنی رینگر، فیزیولوژیست انگلیسی قرن نوزدهم، محلول‌های نمکی را برای حفظ ضربان قلب جدا شده حیوانات خارج از بدن ابداع کرد. در سال 1885، ویلهلم روکس، با نگهداری بخشی از نخاع جنین مرغ در محلول نمکی، اصول اولیه کشت بافت را بنیان نهاد. راس گرانویل هریسون، با انتشار نتایج تحقیقات خود در سال‌های 1907 تا 1910، روش‌های کشت سلول و بافت را توسعه داد.

مورفولوژی سلول‌ها در کشت سلول

سلول‌ها در کشت سلول بر اساس شکل و ظاهرشان به سه دسته اصلی تقسیم می‌شوند:

• سلول‌های فیبروبلاستیک: این سلول‌ها کشیده و دو یا چند قطبی هستند و به سطح بستر متصل می‌شوند.

• سلول‌های شبه اپیتلیال: این سلول‌ها چندضلعی و منظم هستند و به صورت لکه‌های مجزا به بستر متصل می‌شوند.

• سلول‌های شبه لنفوبلاست: این سلول‌ها کروی شکل هستند و به صورت معلق در محیط کشت رشد می‌کنند.

شرایط مورد نیاز در آزمایشگاه کشت سلول

کشت سلول در زمینه‌های بالینی، عمدتاً برای ایجاد مدل‌هایی جهت مطالعه زیست‌شناسی سلولی، مکانیسم‌های بیماری و اثرات داروها به کار می‌رود. مزیت اصلی این روش، امکان دستکاری ژن‌ها و مسیرهای مولکولی است. همچنین، استفاده از سلول‌های همگن و شرایط کشت تعریف‌شده، تکرارپذیری و ثبات نتایج را افزایش می‌دهد.

تجهیزات آزمایشگاه کشت سلول

آسپسی، یا ایجاد محیط عاری از میکروارگانیسم‌ها، رکن اصلی کار با کشت سلول است. برای دستیابی به این هدف، استفاده از تجهیزات زیر ضروری است:

• میکروسکوپ نوری معکوس: برای مشاهده و بررسی سلول‌ها

• یخچال و فریزر: برای نگهداری سلول‌ها و مواد

• سانتریفیوژ: برای جداسازی سلول‌ها

• pH متر: برای تنظیم pH محیط کشت

• پیپت و پیپتور: برای انتقال حجم‌های دقیق مایعات

• محیط کشت و مکمل‌ها: برای تغذیه سلول‌ها

• هماسی سنج: برای شمارش سلول‌ها

• اتوکلاو: برای استریل کردن تجهیزات

• پمپ خلاء: برای آسپیراسیون محیط کشت

• حمام آب گرم: برای گرم کردن محیط کشت

• ظروف کشت سلول: برای رشد سلول‌ها

• ظروف زباله زیست‌خطرناک: برای دفع ایمن زباله‌ها

رده‌های سلولی در کشت سلول: انتخاب، ویژگی‌ها و تنظیمات محیطی

انتخاب یک رده سلولی برای کشت سلولی به‌طور چشمگیری وابسته به خواص عملکردی و نیازهای مدل سلولی مورد نظر است. این انتخاب باید مطابق با تجهیزات موجود و الزامات ایمنی و گروه خطر مربوط به سلول‌ها باشد. در آزمایشگاه‌های کشت سلولی، سلول‌های کشت‌شده را می‌توان به سه دسته اصلی تقسیم کرد:

۱. سلول‌های اولیه (Primary cells)

سلول‌های اولیه مانند فیبروبلاست‌های به‌دست آمده از بیوپسی پوست یا سلول‌های کبدی جدا شده از نمونه‌های کبدی، مستقیماً از بافت انسان استخراج می‌شوند. تحقیقات زیست‌پزشکی و پژوهش‌های ترجمه‌ای اغلب به استفاده از این نوع سلول‌ها متکی هستند، زیرا این سلول‌ها نماینده دقیقی از بافت منشأ خود محسوب می‌شوند. با این حال، استفاده از سلول‌های اولیه محدودیت‌های ایمنی زیستی دارد و به عرضه مداوم ذخایر نیازمندند؛ زیرا تکثیر آن‌ها پس از تعداد محدودی تقسیم متوقف شده و گسترش سلول غالباً غیرممکن است.

۲. سلول‌های تبدیل شده (Transformed cells)

سلول‌های ترنسفرم شده می‌توانند به‌طور طبیعی یا از طریق دست‌کاری ژنتیکی تولید شوند. استفاده از این رده‌های سلولی منجر به ایجاد یک پلت فرم سلولی می‌شود که نرخ رشد سریع و شرایط پایدار را برای نگه‌داری و شبیه‌سازی فراهم می‌آورد. اما باید توجه داشت که دستکاری ژنتیکی ممکن است منجر به ناهنجاری‌های کاریوتیپی و فنوتیپ‌های غیر فیزیولوژیکی گردد. به‌عنوان نمونه، رده‌های سلولی استاندارد مشتق شده از گونه‌های انسانی یا غیر انسانی مانند سلول‌های HeLa، CHO و HUVEC اغلب مشخص و راه‌اندازی آن‌ها آسان‌تر است.

۳. سلول‌های خود تجدید شونده (Self-renewing cells)

این دسته شامل سلول‌های بنیادی جنینی، سلول‌های بنیادی پرتوان القایی، سلول‌های بنیادی عصبی و روده‌ای می‌شود. سلول‌های خود تجدید شونده قابلیت تمایز به انواع سلول‌های دیگر را دارند و خاصیت خود تجدیدپذیری آن‌ها امکان نگه‌داری طولانی‌مدت در شرایط آزمایشگاهی را فراهم می‌آورد. این سلول‌ها معمولاً به عنوان نماینده‌های فیزیولوژیکی واقعی از بافت‌های in vivo عمل می‌کنند. خطوط سلولی به صورت تجاری از طریق بانک‌های سلولی یا آزمایشگاه‌های معتبر تأمین می‌شوند و همواره آزمایش‌هایی مانند Mycoplasma PCR برای اطمینان از عدم آلودگی صورت می‌گیرد.

کشت سلولی: شرایط محیطی و تنظیمات محیط رشد

محیط کشت سلولی چیست؟

هدف از ساخت محیط کشت سلولی ایجاد فضایی است که شرایط رشد بهینه را برای سلول‌ها فراهم کند. این محیط از دو بخش اصلی تشکیل شده است:

• محیط پایه: شامل مواد مغذی ضروری مانند کربوهیدرات‌ها، ویتامین‌ها، اسیدهای آمینه، مواد معدنی و عوامل رشد (مثلاً سرم گاوی جنین FBS) می‌باشد.

• مکمل‌ها: که شامل هورمون‌ها، عوامل تنظیم‌کننده pH، فشار اسمزی و گازهایی مانند O2 و CO2 است.

تنظیم دقیق دما، رطوبت و ترکیب گازها (به ویژه CO2 و O2) از طریق دستگاه‌های انکوباتور، پایه‌ای اساسی برای رشد سلول‌های کشت‌شده فراهم می‌کند.

بسترهای کشت سلولی و نحوه تنظیم تراکم سلولی

انتخاب بستر رشد (جامد یا نیمه‌جامد) و تنظیم تراکم سلولی دو عامل کلیدی در تقلید ریز محیط فیزیولوژیکی هستند. سلول‌های چسبنده معمولاً به بسترهای فیزیکی نیاز دارند تا ماتریکس خارج سلولی را تقلید کنند و تعاملات سلولی به‌درستی برقرار گردد؛ در حالی که سلول‌های در حالت سوسپانسیون، به شکل کروی رشد کرده و برای آزمایش‌هایی مانند جداسازی پروتئین‌های نوترکیب مناسب‌تر هستند.

سرم در کشت سلول

سرم گاوی جنینی (FBS) به‌عنوان یک مکمل حیاتی به محیط کشت اضافه می‌شود تا فاکتورهای رشد، هورمون‌ها، لیپیدها و آنزیم‌های مورد نیاز سلول‌ها را فراهم کند. با این حال، به دلیل تفاوت‌های بین دسته‌ای و احتمال آلودگی، استفاده از سرم‌های استاندارد و تأیید شده توصیه می‌شود. همچنین، برخی محیط‌های کشت کاهش یافته یا فاقد سرم به‌منظور کنترل بهتر شرایط رشد ایجاد شده‌اند که در آن‌ها سرم توسط اجزای تعریف‌شده جایگزین می‌شود.

تنظیم دما، pH، CO2 و O2 در کشت سلول

• دما: رده‌های سلولی انسان و پستانداران معمولاً در دمای 36 تا 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه می‌شوند. برای سلول‌های منشأ حیوانات خونسرد، دما ممکن است در محدوده 15 تا 26 درجه سانتی‌گراد تنظیم شود.

• pH: برای بیشتر رده‌های سلولی انسان و پستانداران، pH محیط کشت باید بین 7.2 تا 7.4 حفظ شود. سلول‌های فیبروبلاست ممکن است شرایط قلیایی‌تری را ترجیح دهند.

• ترکیب گازی: انکوباتورها باید ترکیبی از CO2 و هوا را فراهم کنند؛ تنظیم دقیق CO2 (معمولاً 5-7 درصد) به حفظ تعادل pH (از طریق سیستم بی‌کربنات) کمک می‌کند.

• بافرها: استفاده از بافرهایی مانند HEPES یا MOPS برای حفظ pH و جلوگیری از تغییرات ناگهانی محیط کشت بسیار مفید است.

 تهیه و استریل‌سازی ظروف شیشه‌ای

۱. اهمیت استفاده از ظروف شیشه‌ای

ظروف شیشه‌ای به دلیل کیفیت بالا، شفافیت و مقاومت شیمیایی مزایای زیادی در کشت سلولی دارند. اما بازیافت و تمیز کردن صحیح آن‌ها از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است؛ زیرا باقی‌ماندن هرگونه ماده شوینده یا رسوبات می‌تواند بر روی رشد و رفتار سلول‌ها تأثیر بگذارد.

۲. پروتکل‌های تمیزکاری ظروف شیشه‌ای

برای تضمین تمیزی و استریل بودن ظروف شیشه‌ای، پروتکل‌های زیر پیشنهاد می‌شود:

• آموزش و معرفی لوازم آزمایشگاهی: تمامی پرسنل باید با وسایل پرکاربرد، روش‌های تمیزکاری و گواهینامه‌های مربوط آشنا شوند.

• جابجایی ظروف شیشه‌ای با دقت: در حین جابجایی ظروف، دقت لازم به کار رود زیرا بیشتر شکستگی‌ها در این مرحله رخ می‌دهد.

• پیش‌استریل کردن ظروف: قبل از تمیزکاری، ظروف شیشه‌ای باید به وسیله اتوکلاو یا خیساندن یک شب در محلول کلر (۰.۵ درصد) ضدعفونی شوند.

• ضدعفونی پیپت‌ها: پیپت‌ها نیز در ظرف حاوی محلول کلر ضدعفونی شوند.

• شستشوی سریع پس از استفاده: ظرف‌های شیشه‌ای بلافاصله پس از استفاده باید شسته شوند تا از خشک شدن مواد باقی‌مانده جلوگیری شود.

• نگهداری ظروف آلوده: اجسام آلوده در آب حاوی مواد ضدعفونی‌کننده یا پاک‌کننده نگهداری شوند تا از رسوب مواد جلوگیری شود.

• استفاده از مواد شوینده مخصوص: برای تمیز کردن کامل ظروف شیشه‌ای، از مواد شوینده 7X - DECON یا معادل‌های آن استفاده شود؛ هرگز از شوینده مایع ظرفشویی استفاده نکنید.

• تمیزکاری با برس: شیشه‌ها با استفاده از برس تمیز شوند. برس‌ها به‌طور دوره‌ای باید از نظر سایش بررسی شوند تا از خراشیدن سطح شیشه جلوگیری گردد.

• شستشوی نهایی با آب مقطر یا دیونیزه: ظروف باید حداقل ۵ تا ۷ بار با آب مقطر یا دیونیزه شسته شوند تا باقی‌ماندن هرگونه ماده شوینده یا ضدعفونی‌کننده کاملاً از بین برود.

• خشک کردن: ظروف شیشه‌ای باید روی قفسه‌ها یا تخته‌های گیره خشک شوند و پس از خشک شدن بررسی شوند. در صورتی که ظروف کدر، دارای بیوفیلم یا لکه باشند، قبل از استفاده نیاز به تمیزکاری اضافی دارند.

• استریل‌سازی حرارتی: ظروف شیشه‌ای می‌توانند با قرار دادن در کوره هوای گرم در دمای ۱۸۰ درجه سانتی‌گراد به مدت سه ساعت برای از بین بردن پیروژن‌ها استریل شوند.

• استفاده از روش‌های شیمیایی: در موارد بسیار کثیف، ممکن است نیاز به شستشو با اسید کرومیک (یا جایگزین‌های تجاری امن‌تر مانند محصولات فیشر، Contrad 70 یا Nochromix) باشد؛ در این صورت باید تمامی اقدامات ایمنی مربوط به استفاده از اسیدهای غلیظ رعایت شود.

• شستشو و استریل نهایی: تمام محلول‌های تمیزکننده باید پس از استفاده به‌طور کامل از ظروف شیشه‌ای حذف شوند تا هیچگونه باقی‌مانده‌ای باقی نماند.

 سیستم‌های کشت سلولی و انتخاب ظروف

۱. انتخاب سیستم‌های کشت سلولی

در کشت سلولی، سیستم‌های مختلفی وجود دارد که بر اساس نوع سلول‌های مورد استفاده طراحی شده‌اند. برخی سیستم‌ها از ظروف شیشه‌ای استفاده می‌کنند و برخی از ظروف پلاستیکی یکبار مصرف. برای آزمایشگاه‌های مرجع و تحقیقاتی که نیاز به خطوط سلولی استاندارد دارند، توصیه می‌شود از مجموعه‌های رسمی تهیه شوند. پس از دریافت کشت سلولی، بلافاصله یک بانک سلولی در نیتروژن مایع یا در فریزر مکانیکی در دمای منفی ۷۰ درجه سانتی‌گراد ایجاد شود تا از تخریب سلول‌ها جلوگیری گردد.

۲. آماده‌سازی سیستم‌های کشت سلولی

سلول‌ها باید با شواهد مستند از ویژگی‌های کلیدی کیفیت کشت سلولی دریافت شوند. علاوه بر جلوگیری از آلودگی میکروبی، پرسنل آزمایشگاه باید از آلودگی محیط کار با مواد کشت سلولی نیز جلوگیری کنند. تمامی مراحل کشت، چه تلقیح شده و چه بدون تلقیح، به‌طور جدی باید مدیریت شوند تا از آلودگی‌های متقاطع جلوگیری شود. پس از پایان استفاده، تمامی ظروف و مایعات کشت باید با اتوکلاو یا روش‌های ضدعفونی مناسب پاکسازی شوند.

۳. محیط‌های کشت سلولی

محیط کشت سلولی شامل یک ظرف مناسب است که بستر یا محیط حاوی مواد مغذی (اسیدهای آمینه، کربوهیدرات‌ها، ویتامین‌ها، مواد معدنی) و عوامل رشد، هورمون‌ها و گازهای لازم (O2 و CO2) را فراهم می‌کند. شرایط فیزیکی مانند pH، فشار اسمزی و دما نیز باید به دقت تنظیم شوند. برخی سلول‌ها به عنوان سلول‌های چسبنده کشت می‌شوند و به یک بستر ثابت متکی هستند، در حالی که سلول‌های تعلیقی به صورت شناور در محیط رشد می‌کنند.

نگهداری و دستکاری سلول‌های کشت شده

۱. نگهداری سلول‌ها در انکوباتور

سلول‌ها در انکوباتورهای CO2 در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد و با رطوبت کنترل شده نگهداری می‌شوند. شرایط کشت باید به گونه‌ای تنظیم شود که علاوه بر دما و گازهای محیط، عوامل محیطی مانند pH، غلظت مواد مغذی و فاکتورهای رشد نیز بهینه باشند. تغییر محیط کشت به‌طور منظم (تعویض محیط) برای تأمین مواد مغذی و حذف متابولیت‌های سمی اهمیت دارد.

۲. دستکاری سلول‌های کشت شده

با توجه به اینکه سلول‌ها به طور پیوسته در حال تقسیم هستند، لازم است عملیات پاساژ (subculturing) به‌صورت منظم انجام شود. این عمل شامل برداشت سلول‌ها از ظرف کشت اصلی، جدا کردن سلول‌های چسبیده (با استفاده از آنزیم‌ها یا روش‌های مکانیکی) و انتقال آن‌ها به ظروف جدید می‌شود. همچنین، برای جلوگیری از آلودگی‌های متقاطع، توصیه می‌شود خطوط سلولی مختلف به‌طور همزمان پردازش نشوند و تمامی وسایل مورد استفاده بعد از کار ضدعفونی شوند.

۳. شمارش سلول‌ها و تعیین زیست‌پذیری

برای شروع کشت جدید یا تعیین میزان رشد سلولی، شمارش سلول‌ها اهمیت ویژه‌ای دارد. به طور معمول، سلول‌ها از طریق ترکیب 1:1 با محلول تریپان بلو رنگ‌آمیزی می‌شوند و با استفاده از هموسایتومتر تعداد سلول‌های زنده (که رنگ آن‌ها تمایز یافته است) مشخص می‌شود. این کار به تعیین غلظت سلولی و ارزیابی درصد سلول‌های زنده (معمولاً 80 تا 95 درصد) کمک می‌کند.

فریز و دفریز سلول‌ها

۱. فرآیند فریز سلول‌ها

هنگامی که سلول‌های مازاد در ساب‌کالچر آماده باشند، می‌توان آن‌ها را برای استفاده‌های بعدی ذخیره کرد. فریز سلول‌ها با افزودن عوامل محافظ مانند گلیسرول یا DMSO انجام می‌شود تا از تشکیل بلورهای یخی مضر جلوگیری شود. در این روش:

• سلول‌ها از ظرف کشت جدا شده و به‌طور یکنواخت در محیط انجماد (معمولاً شامل محیط سرم حذف‌شده به همراه ۱۰ درصد DMSO) معلق می‌شوند.

• تعداد مشخصی از سلول‌ها (مثلاً 10^6 سلول در هر ویال) به هر کرایوویال منتقل می‌شود.

• ویال‌ها ابتدا به‌طور کنترل‌شده در دمای منفی 80 درجه سانتی‌گراد قرار داده می‌شوند تا با نرخ انجماد تقریباً 1 درجه سانتی‌گراد در دقیقه سرد شوند.

• پس از انجماد، ویال‌ها به‌منظور نگهداری طولانی‌مدت به مخزن نیتروژن مایع منتقل می‌شوند.

۲. فرآیند دفریز سلول‌های منجمد

برای بازیابی سلول‌های منجمد:

• ویال‌ها از مخزن نیتروژن مایع خارج شده و به‌سرعت در حمام آب گرم (معمولاً 37 درجه سانتی‌گراد) قرار داده می‌شوند تا سلول‌ها به آرامی ذوب شوند.

• پیش از ذوب کامل، به منظور کاهش استرس اسمزی ناشی از رقیق شدن DMSO، به‌طور قطره‌ای محیط کشت پیش‌گرم به سلول‌ها اضافه می‌شود.

• پس از ذوب کامل، سلول‌ها با سانتریفیوژ جدا شده، شسته و در محیط کشت تازه معلق می‌شوند.

• سلول‌های به‌دست آمده به ظرف کشت منتقل شده و اجازه داده می‌شود تا به‌طور طبیعی به سطح کشت بچسبند و رشد خود را از سر بگیرند.

آزمایش‌های کشت سلولی به‌طور گسترده در تحقیقات زیست‌پزشکی، پزشکی بازساختی و تولیدات زیست‌فناوری به کار می‌روند. با توجه به محدودیت‌های قانونی در استفاده از حیوانات آزمایشگاهی و اجرای دقیق اصل ۳R (جایگزینی، کاهش و بهینه‌سازی) که توسط ویلیام راسل و رکس برچ به منظور بهبود رفاه حیوانات پیشنهاد شده است، انتظار می‌رود که استفاده از رده‌های سلولی در سال‌های آینده افزایش یابد تا جایگزین آزمایش‌های مبتنی بر حیوانات گردد.

با این حال، خطاهای آزمایشگاهی در کشت سلولی می‌تواند منجر به تولید نتایج غیرقابل اعتماد شود؛ بنابراین، رعایت اصول خوب کشت سلولی (GCCP) برای تضمین تکرارپذیری آزمایش‌های درون‌کشتگاهی (in vitro) ضروری است.

برخی از مشکلات رایج در کشت سلولی عبارتند از:

• آلودگی متقاطع بین گونه‌ای و درون‌گونه‌ای و خطای شناسایی سلولی

• تغییرات ژنتیکی (رانش ژنتیکی)

• آلودگی با باکتری‌ها، قارچ‌ها، مخمرها، ویروس‌ها یا مواد شیمیایی

• عدم انجام تست‌های کنترل کیفیت

در دهه‌های اخیر، محققان دستورالعمل‌های متعددی را برای کشت مناسب سلول و بافت (GCCP) تدوین کرده‌اند. این دستورالعمل‌ها شامل:

• مدیریت کیفیت

• اصول اساسی در سیستم‌های کشت سلولی

• مستندسازی و گزارش‌دهی دقیق

• دستورالعمل‌های کلی ایمنی زیستی

• آموزش و مهارت‌آموزی پژوهشگران

• مسائل اخلاقی مرتبط با کشت سلولی

این دستورالعمل‌ها به استانداردسازی و بهینه‌سازی روش‌های آزمایشگاهی کمک کرده و کار پژوهشگران را مطابق با قوانین، مقررات و اصول اخلاقی تنظیم می‌کنند. همچنین اطلاعات جامع و دقیقی درباره تجهیزات ضروری و پیشرفته برای آزمایشگاه‌های کشت سلولی ارائه می‌دهند. با این وجود، به دلیل پیچیدگی و جامعیت این دستورالعمل‌ها، بیشتر برای پژوهشگران باتجربه طراحی شده‌اند.

در این مقاله، جنبه‌های عمومی کار با رده‌های سلولی به شکلی ساده‌تر توضیح داده شده است. در این بررسی به‌طور خلاصه به احراز هویت سلولی، آلودگی‌های احتمالی کشت سلولی، مسائل اخلاقی و نکات ایمنی زیستی در پژوهش‌های زیست‌پزشکی پرداخته شده تا اطلاعات مفیدی برای تازه‌واردان به حوزه کشت سلولی فراهم آید.

2. طبقه‌بندی انواع کشت سلولی

در دنیای پیچیده و پویای کشت سلولی، رده‌های سلولی به عنوان ابزاری قدرتمند، نقشی حیاتی در پیشبرد تحقیقات زیستی و پزشکی ایفا می‌کنند. این رده‌ها را می‌توان بر اساس ویژگی‌ها و رفتارهای رشدی به سه دسته اصلی تقسیم کرد:

1. رده‌های سلولی محدود (Finite Cell Lines):

   • این رده‌ها، که اغلب از کشت‌های اولیه (Primary Cultures) مشتق می‌شوند، دارای نرخ رشد نسبتاً پایینی هستند.

   • طول عمر محدودی دارند و پس از چند بار تقسیم سلولی، فرآیند پیری و پیرشدگی (Senescence) را تجربه می‌کنند.

   • از دست دادن شکل طبیعی سلول و تجمع لیپیدهای سیتوپلاسمی از جمله علائم این فرآیند است.

   • این سلول‌ها دارای پدیده مهار تماسی (Contact Inhibition) هستند، به این معنی که پس از تشکیل یک لایه تک سلولی (Monolayer)، رشد آن‌ها متوقف شده و وارد فازهای G0، G1 یا G2 چرخه سلولی می‌شوند.

2. رده‌های سلولی پایدار یا جاودانه (Continuous Cell Lines / Immortalized Cell Lines):

   • این رده‌ها، که معمولاً از سلول‌های سرطانی یا سلول‌های تغییر یافته (ترانسفورم‌شده) به دست می‌آیند، توانایی تکثیر نامحدود دارند.

   • در مقایسه با رده‌های سلولی محدود، سرعت تکثیر بالاتری داشته و می‌توانند به تراکم‌های سلولی بسیار بیشتری در محیط کشت دست یابند.

   • برخی از این سلول‌ها دارای ناهنجاری‌های کروموزومی مانند آنیوپلوئیدی (Aneuploidy) یا هتروپلوئیدی (Heteroploidy) هستند.

   • این سلول‌ها می‌توانند در غلظت‌های پایین‌تر سرم رشد کنند، فاقد مهار تماسی بوده و لایه‌های چندگانه سلولی تشکیل دهند.

3. رده‌های سلولی بنیادی (Stem Cell Lines):

   • این سلول‌ها، که نوعی سلول‌های پرتوان (Pluripotent) هستند، توانایی خودنوسازی و تمایز به انواع مختلف سلولی را دارند.

   • تحت شرایط خاصی، می‌توانند به سلول‌های تخصصی تمایز یابند و به عنوان پیش‌سازهای چندتوانی (Multipotent Precursor) برای بسیاری از انواع سلولی عمل کنند.

ویژگی‌های رشد سلولی:

• ویژگی‌های رشد سلولی به منبع سلول و نوع کشت بستگی دارد و نیازمند محیطی کنترل‌شده است.

• برخی از سلول‌ها به صورت چسبیده (Adherent) رشد می‌کنند و برای پاساژ دادن، نیاز به عامل جداکننده (Detaching Agent) دارند.

• برخی دیگر به صورت معلق (Suspension) در محیط مایع رشد می‌کنند و نیازی به جداسازی ندارند.

  • سلول های چسبیده خود به دو دسته تقسیم میشوند:

    • سلول‌های شبه فیبروبلاستی (Fibroblast-like Cells): دارای شکل کشیده.

    • سلول‌های شبه اپی‌تلیالی (Epithelial-like Cells): دارای شکل چند ضلعی.

  • سلول های معلق:

    • سلول‌های معلق (Non-adherent / Suspension Cells) به صورت سلول‌های منفرد یا توده‌های شناور در محیط مایع رشد می‌کنند.

    • برای پاساژ دادن، نیازی به جداسازی آنزیمی یا مکانیکی ندارند.

    • برخی از سلول‌های معلق برای تبادل گاز مناسب و رشد بهتر، نیاز به هم زدن یا چرخاندن محیط کشت دارند.

    • سلول‌های خونساز (Hematopoietic Cell Lines) نمونه‌ای از این نوع سلول‌ها هستند.

    • برخی از سلول‌های چسبیده را می‌توان به فرم معلق تطبیق داد، که در کاربردهایی مانند کشت سلولی در مقیاس بزرگ و تولید انبوه سلول‌ها مفید است.

مزایای سلول‌های معلق:

• سلول‌های معلق نسبت به سلول‌های چسبیده، مدیریت ساده‌تری دارند.

• به عنوان مثال، در سیتومتری جریان (Flow Cytometry) یا جداسازی سلول با فلوسایتومتری (FACS)، سلول‌های چسبیده باید ابتدا از سطح جدا شوند.

• آنزیم‌هایی مانند تریپسین اغلب برای جداسازی سلول‌ها استفاده می‌شوند، اما می‌توانند پروتئین‌های سطح سلولی را تجزیه کنند.

• این امر می‌تواند شناسایی و جداسازی سلولی را در آزمایش‌ها مختل کند.

آنزیم‌های جداکننده سلول‌های چسبیده:

• تریپسین (Trypsin): پروتئین‌های سطح سلولی را با برش پپتیدها پس از لیزین یا آرژینین تجزیه می‌کند.

• کلاژناز (Collagenase): پروتئین‌های ماتریکس خارج سلولی را تجزیه می‌کند.

• الاستاز (Elastase): پیوندهای پپتیدی در انتهای C آمینو اسیدهای خنثی را تجزیه می‌کند.

• دیپاز (Dispase): پیوندهای N ترمینال اسیدهای آمینه غیرقطبی را تجزیه می‌کند.

• برای کاهش اثرات مخرب آنزیم‌ها، از جایگزین‌های ملایم‌تری مانند Accutase و Accumax یا محلول‌های غیرآنزیمی مانند EDTA و NTA استفاده می‌شود که ساختار اپی‌توپ‌های سطح سلولی را حفظ می‌کنند.

3. محیط کشت سلولی

• انتخاب محیط کشت مناسب برای حفظ و رشد سلول‌ها، تأثیر بسزایی در قابلیت تکرارپذیری آزمایش‌های سلولی دارد.

• برخی از سلول‌ها برای رشد مؤثر، به اسیدهای آمینه غیرضروری (مانند آلانین، آسپاراژین، آسپارتیک اسید، گلوتامیک اسید، گلیسین، پرولین و سرین) نیاز دارند.

• رایج‌ترین محیط‌های کشت استاندارد برای رشد انواع سلول‌های پستانداران عبارتند از:

  • Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)

  • Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium

• این محیط‌ها معمولاً حاوی کربوهیدرات‌ها، اسیدهای آمینه، ویتامین‌ها، نمک‌ها و یک سیستم بافری pH هستند.

• ترکیبات دقیق آن‌ها بسته به نوع سلول ممکن است تغییر کند.

ترکیب‌بندی محیط کشت Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) با گلوکز بالا:

محیط کشت DMEM با گلوکز بالا، یکی از رایج‌ترین محیط‌های کشت برای رشد سلول‌های پستانداران است. این محیط حاوی ترکیبات ضروری برای رشد سلول‌ها است که در زیر به تفصیل شرح داده شده است:

• نمک‌های معدنی / بافرها:

  • CaCl2: 0.2 گرم در لیتر (برای تامین کلسیم مورد نیاز سلول‌ها)

  • Fe(NO3)3 × 9 H2O: 0.0001 گرم در لیتر (برای تامین آهن مورد نیاز سلول‌ها)

  • MgSO4: 0.09767 گرم در لیتر (برای تامین منیزیم مورد نیاز سلول‌ها)

  • KCl: 0.4 گرم در لیتر (برای تامین پتاسیم مورد نیاز سلول‌ها)

  • NaHCO3: 3.7 گرم در لیتر (به عنوان سیستم بافری برای حفظ pH محیط کشت)

  • NaCl: 6.4 گرم در لیتر (برای حفظ فشار اسمزی محیط کشت)

  • NaH2PO4: 0.109 گرم در لیتر (به عنوان سیستم بافری برای حفظ pH محیط کشت)

• اسیدهای آمینه:

  • L-Arginine × HCl: 0.084 گرم در لیتر (برای سنتز پروتئین)

  • L-Glutamine: 0.584 گرم در لیتر (برای سنتز پروتئین و تامین انرژی) (در برخی فرمول‌ها باید تازه اضافه شود)

  • Glycine: 0.03 گرم در لیتر (برای سنتز پروتئین)

  • L-Histidine × HCl × H2O: 0.042 گرم در لیتر (برای سنتز پروتئین)

  • L-Isoleucine: 0.105 گرم در لیتر (برای سنتز پروتئین)

  • L-Leucine: 0.105 گرم در لیتر (برای سنتز پروتئین)

  • L-Lysine × HCl: 1.46 گرم در لیتر (برای سنتز پروتئین)

  • L-Phenylalanine: 0.066 گرم در لیتر (برای سنتز پروتئین)

  • L-Serine: 0.042 گرم در لیتر (برای سنتز پروتئین)

  • L-Threonine: 0.095 گرم در لیتر (برای سنتز پروتئین)

  • L-Tryptophan: 0.016 گرم در لیتر (برای سنتز پروتئین)

  • L-Tyrosine × 2 Na × 2 H2O: 0.12037 گرم در لیتر (برای سنتز پروتئین)

  • L-Valine: 0.094 گرم در لیتر (برای سنتز پروتئین)

• ویتامین‌ها:

  • Choline chloride: 0.004 گرم در لیتر (برای سنتز فسفولیپیدها)

  • Folic acid: 0.004 گرم در لیتر (برای سنتز DNA)

  • myo-Inositol: 0.0072 گرم در لیتر (برای متابولیسم لیپیدها)

  • Niacinamide: 0.004 گرم در لیتر (برای متابولیسم انرژی)

  • D-Pantothenic acid (hemicalcium): 0.004 گرم در لیتر (برای متابولیسم انرژی)

  • Pyridoxal hydrochloride: 0.004 گرم در لیتر (برای متابولیسم اسیدهای آمینه)

  • Riboflavin: 0.0004 گرم در لیتر (برای متابولیسم انرژی)

  • Thiamine × HCl: 0.004 گرم در لیتر (برای متابولیسم انرژی)

• ترکیبات دیگر:

  • D-Glucose: 4.5 گرم در لیتر (به عنوان منبع انرژی) (در DMEM با گلوکز پایین، این مقدار 1 گرم در لیتر است)

  • Phenol red × Na: 0.0159 گرم در لیتر (به عنوان نشانگر pH) (دارای فعالیت ضعیف استروژنی است و در برخی فرمولاسیون‌های DMEM حذف می‌شود)

  • Pyruvic acid × Na: 0.11 گرم در لیتر (به عنوان منبع انرژی)

محیط‌های کشت رایج و استفاده از سرم در کشت سلولی:

• محیط‌های استانداردی مانند DMEM معمولاً به دو صورت در دسترس هستند:

  • مایع آماده‌به‌استفاده

  • محیط پودری که ماندگاری طولانی‌تری دارد و ذخیره‌سازی آن راحت‌تر است.

• بسیاری از محیط‌های کشت با غلظت‌های مختلف گلوکز (کم یا زیاد) و همچنین با یا بدون L-گلوتامین یا با گلوتامین پایدار عرضه می‌شوند.

• این محیط‌ها ممکن است با یا بدون نشانگر pH مانند فنول رد به فروش برسند.

• محیط‌های پایه معمولاً فاقد پروتئین، لیپید، هورمون و فاکتورهای رشد هستند، بنابراین باید با سرم گاوی جنینی (FBS) یا سرم گوساله جنینی (FCS) در غلظتی بین 5 تا 20 درصد حجمی (v/v) غنی شوند.

ویژگی‌های سرم گاوی جنینی (FBS):

• از خون جنین‌های گاوی سالم قبل از تولد گرفته می‌شود.

• پس از لخته شدن خون، با سانتریفیوژ سلول‌ها، فیبرین و فاکتورهای انعقادی حذف می‌شوند.

• تفاوت بین دسته‌های مختلف FBS در سطح فاکتورهای رشد، هورمون‌ها، ویروس‌ها، اندوتوکسین، اسمولالیته، پروتئین کل، فلزات و قندها می‌تواند تأثیر زیادی بر نتایج آزمایش داشته باشد.

• اکثر محققان FBS با ترکیب قابل‌ردیابی و یکنواخت بین دسته‌ها خریداری می‌کنند.

• انواع دیگر سرم‌های گاوی نیز در کشت سلولی استفاده می‌شوند:

  • سرم گوساله تازه متولدشده (NBCS): از گوساله‌های کمتر از 20 روز سن گرفته می‌شود.

  • سرم گوساله (CBS): از گوساله‌های 3 هفته تا 12 ماهه استخراج می‌شود.

  • سرم گاو بالغ (ABS): از گاوهای بالغ بیش از 12 ماهه گرفته می‌شود.

• برخی از محققان سرم را در دمای 56 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 تا 30 دقیقه حرارت می‌دهند تا سیستم کمپلمان را غیرفعال کرده و آلاینده‌های باکتریایی را از بین ببرند. اما این روش می‌تواند فاکتورهای رشد را نیز تخریب کند، بنابراین در بسیاری از موارد این کار ضروری نیست و باید از آن اجتناب شود.

چالش‌های استفاده از سرم و توسعه محیط‌های بدون سرم (SFM):

• محیط‌های حاوی سرم دارای معایبی هستند:

  • ترکیب پیچیده و نامشخص که باعث تغییرات بین دسته‌ای می‌شود.

  • افزایش خطر آلودگی میکروبی.

  • نگرانی‌های اخلاقی به دلیل استفاده از سرم جنین حیوانات.

• در سال‌های اخیر محیط‌های بدون سرم (SFM) توسعه یافته‌اند که به پنج دسته اصلی تقسیم می‌شوند:

  • محیط‌های بدون سرم استاندارد (Common SFM)

  • محیط‌های بدون زنو (Xeno-Free Media): شامل ترکیبات انسانی اما بدون ترکیبات حیوانی

  • محیط‌های کاملاً عاری از ترکیبات حیوانی (Animal-Free Media)

  • محیط‌های بدون پروتئین (Protein-Free Media)

  • محیط‌های کاملاً تعریف‌شده شیمیایی (Chemically Defined Media)

• این محیط‌ها حاوی منابع انرژی، ویتامین‌ها، اسیدهای آمینه، لیپیدها، عناصر کمیاب و نمک‌های معدنی هستند و اغلب با افزودنی‌های خاص مانند عوامل محافظ در برابر تنش، اسیدهای نوکلئیک، و ترکیبات دیگر غنی می‌شوند.

• برخی شرکت‌های تولیدکننده SFM اطلاعات دقیقی درباره ترکیب آن‌ها ارائه نمی‌دهند. پژوهشگران یک پایگاه داده آنلاین برای تبادل اطلاعات و تجربیات در مورد محیط‌های بدون سرم ایجاد کرده‌اند.

استفاده از آنتی‌بیوتیک‌ها در محیط کشت سلولی:

• برای جلوگیری از آلودگی‌های بیولوژیکی ناشی از باکتری‌ها، مخمرها، قارچ‌ها و مایکوپلاسما، آنتی‌بیوتیک‌ها و ضدقارچ‌ها به محیط‌های کشت اضافه می‌شوند.

• مکانیسم‌های عمل آنتی‌بیوتیک‌ها:

  • پنی‌سیلین (Penicillin): مهار سنتز دیواره سلولی

  • آمفوتریسین B (Amphotericin B): اختلال در نفوذپذیری غشای سلولی

  • استرپتومایسین (Streptomycin): مهار سنتز پروتئین با جلوگیری از تشکیل کمپلکس mRNA و ریبوزوم باکتری

• مشکلات استفاده طولانی‌مدت از آنتی‌بیوتیک‌ها:

  • ایجاد باکتری‌های مقاوم

  • تغییر در تمایز، تکثیر و پایداری ژنتیکی سلول‌ها

  • تغییر در بیان ژن و پاسخ دارویی سلول‌ها

4. فنل قرمز:

فنل قرمز، که با نام علمی فنول‌سولفون‌فتالئین نیز شناخته می‌شود، به عنوان رایج‌ترین نشانگر pH در محیط‌های کشت سلولی مورد استفاده قرار می‌گیرد. این ماده محلول در آب، در شرایط اسیدی (pH پایین) به صورت یک زویتریون زرد رنگ ظاهر می‌شود، در حالی که در محیط‌های بازی‌تر (pH بالا) به شکل آنیون قرمز یا دی-آنیون صورتی تغییر رنگ می‌دهد. این ویژگی باعث شده است که فنل قرمز به عنوان یک نشانگر pH خنثی در بسیاری از محیط‌های کشت بافت، جهت تشخیص تغییرات pH، محصولات زائد سلول‌های در حال مرگ یا رشد بیش از حد آلاینده‌هایی که معمولاً باعث اسیدی شدن محیط می‌شوند، مورد استفاده قرار گیرد.

با این حال، شباهت ساختاری فنل قرمز با برخی از استروژن‌های غیراستروئیدی، باعث شده است که این ماده قابلیت اتصال به گیرنده‌های استروژن را داشته باشد، اگرچه تمایل اتصال آن در مقایسه با استرادیول بسیار پایین‌تر (0.001%) است. با این وجود، فنل قرمز می‌تواند باعث تکثیر سلول‌های مثبت گیرنده استروژن شود. بنابراین، توصیه می‌شود در آزمایش‌هایی که با سیستم‌های سلولی حساس به استروژن انجام می‌شوند، از فنل قرمز استفاده نشود.

5. آلودگی سلولی:

آلودگی در کشت‌های سلولی می‌تواند ناشی از عوامل بیولوژیکی و شیمیایی باشد (جدول 2). در اکثر موارد، آلودگی منجر به رشد کند سلولی، تغییر در مورفولوژی سلول‌ها، تغییر سریع pH محیط و افزایش تعداد سلول‌های مرده یا شناور در کشت می‌شود. بنابراین، بررسی منظم کشت‌های سلولی از نظر آلاینده‌های احتمالی، برای جلوگیری از نتایج ناسازگار و عواقب جدی دیگر، ضروری است. مهم‌ترین آلاینده‌ها در جدول زیر شرح داده شده‌اند.

جدول 2: آلاینده‌های رایج در کشت‌های سلولی

5.1. آلودگی مایکوپلاسما:

مایکوپلاسماها کوچک‌ترین ارگانیسم‌های خودتکثیرشونده هستند که به کلاس باکتریایی مولیکوت‌ها تعلق دارند. آن‌ها دارای غشای پلاسمایی لیپوپروتئینی، ریبوزوم‌ها و یک ژنوم متشکل از یک مولکول DNA دوتایی حلقوی هستند که اندازه آن از 580 تا 2200 کیلوباز متغیر است.

مایکوپلاسماها توانایی‌های بیوسنتزی محدودی دارند و برای تکثیر و بقای طولانی‌مدت به یک میزبان مناسب نیاز دارند. اندازه کوچک آن‌ها (~0.1–0.2 میکرومتر) شناسایی آن‌ها را با میکروسکوپ‌های نوری معمولی غیرممکن می‌کند، که به همین دلیل در بسیاری از آزمایشگاه‌ها تشخیص داده نمی‌شوند. آن‌ها فاقد دیواره سلولی بوده و نسبت به بسیاری از آنتی‌بیوتیک‌های رایج در کشت سلولی مانند پنی‌سیلین یا استرپتومایسین مقاوم هستند. مهم‌تر از همه، آلودگی با مایکوپلاسما باعث کدورت نمی‌شود که معمولاً مشخصه آلودگی‌های باکتریایی یا قارچی دیگر است.

تشخیص گونه‌های مایکوپلاسما در محیط کشت سلولی

(A) مایکوپلاسماها کوچک‌ترین باکتری‌های خودتکثیرشونده هستند که فاقد دیواره سلولی می‌باشند. آن‌ها شامل یک غشای پلاسمایی لیپوپروتئینی، ریبوزوم‌ها و یک ژنوم متشکل از یک مولکول دایره‌ای از DNA دو رشته‌ای هستند.

(B) یک تک‌لایه از یک رده سلولی آلوده به مایکوپلاسما در موش، با رنگ‌آمیزی DAPI مورد بررسی قرار گرفت و با میکروسکوپ فلورسانس و فیلتر UV مناسب (تحریک 340/380 نانومتر) در بزرگنمایی 400× تحلیل شد. نقاط روشن بسیار کوچک خارج از هسته که برای مایکوپلاسماها مشخص هستند (با فلش مشخص شده‌اند) قابل مشاهده هستند. مقیاس نشان داده شده 50 میکرومتر را نمایش می‌دهد.

(C) در این تحلیل، 2 میکرولیتر از محیط کشت کنترل طبیعی (Medium (−)) و 2 میکرولیتر از محیط کشت گرفته شده از یک رده سلولی آلوده به مایکوپلاسما (Medium (+)) جهت آزمایش آلودگی به مایکوپلاسما با استفاده از کیت Venor®GeM OneStep (#11-8050، شرکت Minerva Biolabs GmbH، برلین، آلمان) مطابق دستورالعمل تولیدکننده مورد بررسی قرار گرفتند. به‌عنوان کنترل مثبت، 2 میکرولیتر از کنترل مثبت موجود در کیت نیز همزمان تکثیر شد. کنترل داخلی در هر نمونه که منجر به تولید آمپلیکونی به اندازه 191 جفت‌باز شد، نشان‌دهنده عملکرد صحیح واکنش PCR است، در حالی که آمپلیکون‌های با اندازه 265–278 جفت‌باز نشان‌دهنده آلودگی به گونه‌های مایکوپلاسما هستند. محصولات PCR روی ژل آگاروز 2% حاوی اتیدیوم بروماید جداسازی شده و با یک تصویربردار استاندارد ژل مشاهده شدند.

راه‌های انتقال مایکوپلاسما در محیط کشت سلولی

مطالعات سیستماتیک روش‌های رایج گسترش مایکوپلاسما در محیط کشت سلولی را شناسایی کرده‌اند. این روش‌ها شامل موارد زیر می‌شوند:

• انتقال آلودگی از کشت‌های آلوده، محیط‌های کشت، سرم‌ها یا معرف‌هایی که از سایر آزمایشگاه‌های تحقیقاتی یا تأمین‌کنندگان تجاری به دست آمده‌اند.

• استفاده از تجهیزات غیراستریل، انتقال از کارکنان آزمایشگاهی که ناقل مایکوپلاسما هستند.

• انتشار مایکوپلاسما از طریق انکوباتورها یا هودهای آلوده.

• آلوده شدن محیط‌های کشت در مخازن نیتروژن مایع.

• انتقال از طریق ذرات معلق در هوا و آئروسل‌ها.

• استفاده بیش از حد از آنتی‌بیوتیک‌ها.

• درزگیری نادرست ظروف کشت.

اگرچه مایکوپلاسما با سلول میزبان برای پیش‌سازهای زیستی و مواد مغذی رقابت می‌کند، اما تغییرات مشاهده‌شده در نرخ رشد سلول‌های آلوده اغلب حداقل است. این امر باعث می‌شود که آلودگی به‌راحتی شناسایی نشود. با این حال، مایکوپلاسماها به‌شدت بر DNA، RNA، و متابولیسم پروتئین میزبان تأثیر می‌گذارند، سطح اسیدهای آمینه داخل سلولی و ATP را تغییر می‌دهند، آنتی‌ژن‌های سطح سلولی را اصلاح می‌کنند و منجر به تکه‌تکه شدن DNA و تغییرات کروموزومی قابل توجهی می‌شوند.

به همین دلیل، آزمایش منظم و شناسایی سریع این آلاینده‌ها برای جلوگیری از نتایج نادرست تحقیقات، مقالات گمراه‌کننده، و هدررفت منابع تحقیقاتی بسیار مهم است. روش‌های حساس و دقیقی برای تشخیص این آلودگی‌ها توسعه یافته‌اند که در بسیاری از موارد بدون توجه به منبع یا گونه، آلودگی را شناسایی می‌کنند.

در روش استاندارد طلایی برای تشخیص مایکوپلاسما، نمونه‌ای از محیط کشت سلولی آلوده ابتدا به یک محیط مایع مخصوص کشت مایکوپلاسما اضافه شده و پس از چند روز روی محیط‌های براث، آگار یا سلول‌های شاخص انکوبه می‌شود. این روش اگرچه دقیق است، اما زمان‌بر بوده و روش‌های سریع‌تری برای تشخیص معرفی شده‌اند.

روش‌های تشخیص مایکوپلاسما

این روش‌ها شامل موارد زیر هستند:

• رنگ‌آمیزی DNA با فلوروکروم‌هایی مانند DAPI یا Hoechst 33342

• آزمایش‌های ELISA

• نشانه‌گذاری RNA با پروب‌های ریبوزومی خاص مایکوپلاسما

• روش‌های آنزیمی

• روش‌های فلوسایتومتری

• آزمون‌های رنگ‌سنجی یا نواری برای تشخیص مایکوپلاسما

• تست‌های PCR حساس برای شناسایی RNA ریبوزومی 16S باکتریایی

• تکنیک‌های پیشرفته طیف‌سنجی مادون قرمز تبدیل فوریه (FTIR)

رنگ‌آمیزی با فلوروکروم‌ها اگرچه به‌راحتی انجام می‌شود، اما معمولاً غیرتخصصی است، در حالی که بیشتر روش‌های دیگر حساسیت و اختصاصیت بالایی دارند. به‌ویژه، کیت‌های تجاری PCR که بر اساس روش‌های سنتی (یا انتهای چرخه) طراحی شده‌اند، اغلب قادر به شناسایی هم‌زمان بیش از 70–90 گونه مختلف مایکوپلاسما هستند. این امر به این دلیل است که مجموعه پرایمرهای موجود در این کیت‌ها معمولاً طوری طراحی شده‌اند که ناحیه بسیار حفاظت‌شده ژن 16S rRNA مایکوپلاسما را هدف قرار داده و تکثیر کنند.

روش‌های حذف مایکوپلاسما از محیط کشت سلولی

مایکوپلاسماها می‌توانند اثرات بی‌شماری بر روی کشت‌های آلوده داشته باشند. به همین دلیل، مجموعه گسترده‌ای از عوامل و روش‌ها برای ریشه‌کنی این آلاینده‌ها توسعه یافته‌اند. روش‌های مختلفی از جمله درمان‌های فیزیکی، شیمیایی، ایمنی‌شناسی و شیمی‌درمانی برای حذف مایکوپلاسماها در دسترس هستند.

در ابتدا، آنتی‌بیوتیک‌هایی که رشد مایکوپلاسما را سرکوب می‌کردند معرفی شدند، اما بسیاری از آن‌ها تأثیر متوسطی داشتند، به سلول‌های یوکاریوتی آسیب می‌زدند، یا به‌دلیل مقاومت باکتریایی اثربخشی محدودی داشتند. با این حال، امروزه چندین عامل ضد‌مایکوپلاسما انتخابی و مؤثر در دسترس هستند که معمولاً در یک دوره درمانی به مدت دو تا سه هفته، آلودگی‌های مایکوپلاسما را از بین می‌برند.

این ترکیبات اثرات بالایی در حذف آلودگی‌های مایکوپلاسما دارند و معمولاً در عرض دو تا سه هفته پس از استفاده، تمام گونه‌های رایج مایکوپلاسما را از بین می‌برند.

پاک‌سازی آلودگی مایکوپلاسما در کشت سلولی موش بر اساس ارزیابی با میکروسکوپ الکترونی

یک کشت سلولی آلوده با Plasmocin به مدت دو هفته تیمار شد. تصاویر میکروسکوپ الکترونی نشان‌دهنده سلول‌های آلوده قبل از تیمار (A–C) و پس از تیمار (D) با این ترکیب ضد‌مایکوپلاسما با طیف گسترده هستند. این تصاویر نشان می‌دهند که مایکوپلاسماها به طور موفقیت‌آمیزی از محیط کشت حذف شده‌اند. تصاویر با بزرگنمایی اصلی 4646× تا 27,800× گرفته شده‌اند. لطفاً به ویژگی ادغام غشای مایکوپلاسما با غشای سیتوپلاسمی سلول میزبان در تصویر (A) توجه کنید.

با این حال، درمان یا پیشگیری از آلودگی مایکوپلاسما با این ترکیبات ممکن است اثرات سمی و ژنوتوکسیک قابل توجهی ایجاد کند [48]. به عنوان مثال، مینوسیکلین باعث القای Bcl-2 می‌شود که در میتوکندری تجمع یافته و با مولکول‌های القاکننده مرگ سلولی از جمله Bax، Bak و Bid تعامل دارد و در نتیجه از مرگ سلولی محافظت می‌کند [49]. به طور مشابه، تیامولین از طریق مهار فعالیت 5′-نوکلئوتیداز (CD73) که تبدیل نوکلئوتیدهای 5′ پورینی به نوکلئوزیدها را کاتالیز می‌کند، باعث سرکوب رشد و متاستاز سلول‌های سرطان پستان انسانی (MDA-MB-231) و موش (4T1) شده است [50]. بنابراین، استفاده از این ترکیبات برای حذف مایکوپلاسما باید با دقت و بررسی کافی انجام شود، زیرا ممکن است نتایج مطالعات آزمایشی را تحت تأثیر قرار دهد.

5.2. آلودگی به ویروس‌ها

در مقایسه با عفونت‌های مایکوپلاسما، آلودگی ویروسی در کشت‌های سلولی تهدیدی جدی‌تر محسوب می‌شود زیرا تشخیص آن دشوارتر است و روش‌های درمانی برای از بین بردن این آلودگی وجود ندارد [51]. علاوه بر این، برخی ویروس‌ها قادرند ژنوم خود را درون سلول میزبان ادغام کنند که در برخی موارد منجر به تولید دائمی ذرات ویروسی جدید می‌شود. این موضوع یک خطر بالقوه برای سلامت محققان محسوب شده و می‌تواند منجر به انتقال افقی ویروس به سایر رده‌های سلولی شود. بر همین اساس، این موضوع مستقیماً بر طبقه‌بندی ایمنی زیستی یک رده سلولی آلوده تأثیر می‌گذارد.

متأسفانه، آزمایش‌های عمومی برای بررسی سیستماتیک آلودگی‌های ویروسی پیچیده و غیرهدفمند هستند. بدون داشتن اطلاعات دقیق در مورد نوع ویروس، روش‌های تشخیصی معمولاً محدود به میکروسکوپ الکترونی و آزمون‌های شناسایی ترانس‌کریپتاز معکوس رتروویروسی هستند [52,53]. در این میان، میکروسکوپ الکترونی یک روش مؤثر، عمومی و بی‌طرفانه محسوب می‌شود و برای شناسایی هر نوع عامل ویروسی عفونی مشکوک مناسب است [54].

این روش امکان تصویربرداری با وضوح بالا را فراهم کرده و یک نمای کلی فوری از وضعیت آلودگی سلول‌ها و شکل ویروس‌ها ارائه می‌دهد. مورفولوژی و اندازه ویروس‌های مشاهده‌شده می‌توانند به شناسایی اولیه نوع ویروس کمک کنند [55]. به عنوان مثال، رتروویروس‌های بالغ معمولاً به‌صورت ذرات کروی پوشش‌دار با قطر 100 تا 200 نانومتر مشاهده می‌شوند که دارای ویژگی‌های متمایزی در میان شش جنس رتروویروسی هستند [56].

به ویژه، میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) برای مشاهده مستقیم ویروس‌ها در نمونه‌های زیستی مناسب است بدون اینکه نیاز به فرضیه‌پردازی اولیه درباره عامل عفونی باشد.

به عنوان نمونه، بار ویروسی رتروویروسی در رده سلولی هپاتیک استلاتی موش (GRX) که به طور گسترده در تحقیقات هپاتولوژی استفاده می‌شود، برای اولین بار با استفاده از TEM شناسایی شد [53,57]. حتی پس از گذشت سال‌ها، این رده سلولی هنوز قادر به تولید مقادیر زیادی از ذرات رتروویروسی است (شکل ۵).

شکل ۵: آلودگی رتروویروسی در رده سلولی موش GRX

(A) ساختار کلی یک رتروویروس:

یک رتروویروس ذره‌ای پوشش‌دار با قطر حدود 100 نانومتر است. پوشش ویروسی که توسط ژن env کدگذاری می‌شود، از گلیکوپروتئین‌ها تشکیل شده و طی فرآیند جوانه‌زنی از غشای پلاسمایی سلول میزبان دریافت می‌شود. ژنوم رتروویروسی از دو رشته RNA تک‌رشته‌ای یکسان با طول ۷ تا ۹ کیلوباز تشکیل شده است. آنتی‌ژن‌های اختصاصی گروه (gag) اجزای اصلی کپسید ویروسی را تشکیل می‌دهند، در حالی که آنزیم ترانس‌کریپتاز معکوس (pol) برای سنتز DNA ویروسی ضروری است.

(B) وجود یک رتروویروس نامشخص در رده سلولی هپاتیک استلاتی موش GRX بر اساس تحلیل میکروسکوپ الکترونی. ذرات رتروویروسی را می‌توان در محیط کشت و درون سیتوزول سلول‌ها مشاهده کرد.

(C,D) تصاویر با بزرگنمایی بالاتر از رتروویروس‌ها که ساختار کروی معمولی آن‌ها را نشان می‌دهد.

(E) این تصویر میکروسکوپ الکترونی، فرآیند جوانه‌زنی را نشان می‌دهد که طی آن ذره رتروویروسی پوشش خود را با انتشار از طریق غشای پلاسمایی میزبان دریافت می‌کند.

بزرگنمایی تصاویر:

(B) 10,000× (C) 100,000× (D) 27,800× (E) 21,560×

توضیحات تکمیلی:

• اهمیت میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM):

  • TEM به عنوان یک ابزار قدرتمند در تشخیص ویروس‌ها، به دلیل توانایی آن در ارائه تصاویر با وضوح بالا از ساختار ویروس‌ها، بسیار ارزشمند است.

  • این روش امکان مشاهده مستقیم ویروس‌ها در نمونه‌های زیستی را فراهم می‌کند، بدون اینکه نیاز به فرضیه‌پردازی اولیه در مورد عامل عفونی باشد.

• اثرات سمی و ژنوتوکسیک ترکیبات ضد مایکوپلاسما:

  • در حالی که Plasmocin و سایر ترکیبات ضد مایکوپلاسما می‌توانند به طور مؤثری مایکوپلاسماها را از بین ببرند، باید توجه داشت که این ترکیبات می‌توانند اثرات جانبی نامطلوبی نیز داشته باشند.

  • اثرات سمی و ژنوتوکسیک این ترکیبات می‌تواند نتایج مطالعات آزمایشی را تحت تأثیر قرار دهد.

  • بنابراین، استفاده از این ترکیبات باید با دقت و بررسی کافی انجام شود.

• آلودگی ویروسی در کشت سلولی:

  • آلودگی ویروسی در کشت سلولی یک تهدید جدی است، زیرا تشخیص آن دشوارتر و درمان آن پیچیده‌تر است.

  • برخی ویروس‌ها می‌توانند ژنوم خود را درون سلول میزبان ادغام کنند و منجر به تولید دائمی ذرات ویروسی جدید شوند، که یک خطر بالقوه برای سلامت محققان است.

  • آلودگی ویروسی می‌تواند تأثیر قابل توجهی بر نتایج تحقیقات داشته باشد.

۵.۳. آلودگی شیمیایی

هر ترکیب غیرزنده‌ای که اثرات نامطلوبی در یک کشت سلولی ایجاد کند، نیاز به توجه ویژه دارد. حتی مواد مغذی ضروری نیز در غلظت‌های بالا می‌توانند سمی باشند. ناخالصی‌ها ممکن است از طریق محیط کشت، سرم و آب وارد کشت‌های سلولی شوند. علاوه بر این، پلاستیسایزرها در لوله‌های پلاستیکی، دیسک‌های کشت سلولی و بطری‌های ذخیره‌سازی، همچنین رادیکال‌های آزاد که در محیط کشت بر اثر نور فلورسنت یا UV تشکیل می‌شوند یا رسوبات روی شیشه‌آلات و پیپت‌ها، می‌توانند منجر به آلودگی شوند.

همچنین، ناخالصی‌های موجود در جریان CO₂ و باقی‌مانده‌های مواد ضدعفونی‌کننده یا آفت‌کش‌های مورد استفاده در تمیز کردن انکوباتورها و هودها ممکن است مشکل‌ساز باشند. اندوتوکسین‌ها (Endotoxins) از جمله بحرانی‌ترین آلاینده‌ها هستند که از غشای خارجی باکتری‌های گرم-منفی مشتق می‌شوند. این مواد از لیپوپلی‌ساکاریدهای (LPS) پایدار تشکیل شده‌اند که از باکتری‌ها جدا شده و در مقادیر بسیار بیشتری در طول لیز شدن باکتری‌ها آزاد می‌شوند [58].

ازاین‌رو، حذف پایروژن‌ها (Pyrogens) از شیشه‌آلات نیاز به گرمادهی در دماهای بسیار بالا دارد، زیرا این مواد نسبت به اتوکلاو مقاوم هستند. به همین دلیل، محیط‌های کشت سلولی آماده و مکمل‌های تجاری به گونه‌ای تهیه می‌شوند که فاقد اندوتوکسین باشند یا میزان آن‌ها بسیار کم باشد. علاوه بر این، تولیدکنندگان معتبر محیط‌های کشت سلولی گواهی تحلیل میزان اندوتوکسین‌ها را برای محلول‌ها و ترکیبات مربوطه ارائه می‌دهند.

برخی شرایط کشت سلولی (مانند غلظت پایین سرم و قرارگیری در معرض نور شدید) موجب تشکیل رادیکال‌های آزاد می‌شوند که بسیار واکنش‌پذیر بوده و می‌توانند منجر به آسیب DNA، پیوندهای متقابل پروتئینی، هیدروپراکسیدهای لیپیدی و القای آپوپتوز شوند [59].

بنابراین، آنتی‌اکسیدان‌هایی مانند اسید اسکوربیک (ویتامین C)، ان-استیل-ال-سیستئین (N-acetyl-L-cysteine) و ویتامین‌های A، E و C که خاصیت جمع‌آوری رادیکال‌های آزاد دارند، اغلب به محیط‌های کشت سلولی افزوده می‌شوند تا از استرس اکسیداتیو و پیامدهای آن جلوگیری شود [60,61].

همچنین، سلنیوم به‌عنوان یک عنصر کمیاب که به‌عنوان کوفاکتور در آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی مانند گلوتاتیون پراکسیداز فعالیت می‌کند، می‌تواند به محیط کشت اضافه شود تا پراکسیدهای فعال را خنثی کند [62].

علاوه بر این، غلظت‌های بالای فلزات سنگین مانند سرب، کادمیوم و جیوه برای بسیاری از انواع سلولی سمی هستند. بنابراین، آب و حلال‌هایی که برای تهیه محیط کشت یا مکمل‌ها استفاده می‌شوند، باید از نظر وجود فلزات سنگین مورد آزمایش قرار گیرند. در غیر این صورت، آب خالص تجاری که دارای گواهی تحلیل آزمایشگاهی است، باید استفاده شود، به‌ویژه اگر آب آزمایشگاهی برای کشت سلولی مناسب نباشد.

۵.۴. آلودگی متقابل بین گونه‌ای و درون گونه‌ای

آلودگی رده‌های سلولی با سلول‌های غیرمرتبط از همان گونه (آلودگی درون‌گونه‌ای - Intra-Species Contamination) یا سلول‌های متعلق به گونه‌های دیگر (آلودگی بین‌گونه‌ای - Inter-Species Contamination) یک مشکل شایع و مکرر است [33,34]. به‌ویژه اگر آلودگی ناشی از یک رده سلولی با سرعت تکثیر بالا باشد، این رده ممکن است بر کشت اصلی غالب شده و آن را جایگزین کند.

در صورت عدم تشخیص آلودگی، ممکن است منجر به نتایج نادرست و غیرقابل‌تکرار شود که به‌طور جدی ادبیات علمی زیست‌پزشکی را تحت تأثیر قرار دهد [3]. مشکل آلودگی متقاطع رده‌های سلولی از دهه‌ها پیش شناخته شده است و اولین مورد به بحث‌های مرتبط با سلول‌های HeLa در دهه ۱۹۶۰ بازمی‌گردد [45,46].

در سال ۲۰۱۰، اولین گزارش جامع در مورد این موضوع بر اساس ۶۸ منبع منتشر شد که ۳۶۰ رده سلولی آلوده به آلودگی متقاطع را شناسایی کرد [33]. سپس، در سال ۲۰۲۱، کمیته بین‌المللی احراز هویت رده‌های سلولی (ICLAC) که با هدف افزایش آگاهی محققان در این زمینه فعالیت می‌کند، ۵۷۶ رده سلولی را شناسایی کرد که به دلیل آلودگی متقاطع یا سایر عوامل، هویت نادرستی داشتند [5] (جدول ۴).

دلایل آلودگی متقاطع رده‌های سلولی متعدد هستند و شامل موارد زیر می‌شوند:

• انتقال ناخواسته از طریق آئروسل‌ها

• استفاده از پیپت‌های بدون فیلتر یا مسدود نشده

• به اشتراک گذاشتن محیط‌های کشت و معرف‌ها بین رده‌های سلولی مختلف

• استفاده نادرست از محیط کشت‌های شرطی‌شده (Conditioned Medium) [34]

توضیحات تکمیلی:

• اهمیت کنترل آلودگی شیمیایی:

  • آلودگی‌های شیمیایی می‌توانند به طور قابل توجهی بر نتایج آزمایش‌های کشت سلولی تأثیر بگذارند.

  • رعایت دقیق اصول آسپتیک و استفاده از مواد با کیفیت بالا برای جلوگیری از آلودگی شیمیایی ضروری است.

• اهمیت تشخیص و جلوگیری از آلودگی متقابل:

  • آلودگی متقابل رده‌های سلولی می‌تواند منجر به نتایج نادرست و غیرقابل‌تکرار شود.

  • استفاده از روش‌های مناسب برای شناسایی و جلوگیری از آلودگی متقابل برای حفظ صحت تحقیقات ضروری است.

5.5. شناسایی نادرست سلول‌ها

مشابه آلودگی متقاطع سلولی، شناسایی نادرست خطوط سلولی منجر به هزاران مقاله گمراه‌کننده و نادرست شده است [65]. استفاده از برچسب‌های ناخوانا و اشتباه برچسب‌گذاری ظروف کشت سلولی در حین دستکاری‌های روتین که ناشی از عدم دقت، بار کاری زیاد اپراتور یا حواس‌پرتی در طول آزمایشات است، اصلی‌ترین علت شناسایی نادرست است [66]. این امر قابل درک است که آلودگی با یک سلول آلوده سریع‌تر تقسیم‌شونده می‌تواند در چند نسل کشت اصلی را به سرعت رشد کند و در مراحل بعدی باعث شناسایی نادرست سلول‌ها شود. چنین رشدی زمانی رخ می‌دهد که عملیات تغذیه مجدد و دستکاری‌های چندین کشت با همان پیپت یا در همان زمان انجام شود، یا به عنوان نتیجه‌ای از کشت مشترک انواع مختلف سلول‌ها، یا به دلیل عدم آگاهی هنگام کار با سلول‌های تغذیه‌کننده.

6. پروفایل‌سازی تکرارهای کوتاه متوالی (STR)

امروزه رایج‌ترین روش برای شناسایی آلودگی متقاطع و شناسایی نادرست سلول‌ها، پروفایل‌سازی تکرارهای کوتاه متوالی (STR) است. این روش می‌تواند تعداد تکرارهای آلل در مکان‌های خاص در DNA را بین نمونه‌های مختلف مقایسه کند. اگرچه انواع آللی این تکرارها نسبتاً پلی‌مورفیک هستند، اما تعداد آلل‌ها بسیار کم است. بنابراین، چندین مکان STR به طور همزمان در یک آزمایش PCR چندگانه تجزیه و تحلیل می‌شوند تا پروفایل‌های STR مختلف برای اهداف شناسایی یا تمایز با قدرت آماری بالا استفاده شوند.

در تجزیه و تحلیل STR، نواحی میکروساتیلیت متغیر که از DNA الگو به‌دست آمده است، بر روی یک تحلیلگر ژنتیکی جدا شده و سپس با نرم‌افزاری تجزیه و تحلیل می‌شود که تعداد تکرارها در هر سایت متغیر را محاسبه می‌کند. امروزه پانل‌های STR استاندارد و مؤثر برای بسیاری از گونه‌ها ایجاد شده است. در این زمینه، کنسرسیوم تایید هویت خطوط سلولی موش که یک آزمایش PCR چندگانه شامل 19 نشانگر STR موش را ایجاد کرده است، پیشگام است [66,67]. این PCR چندگانه یک پروفایل STR منحصر به فرد برای خطوط سلولی مختلف موش از جمله خطوط سلولی مرتبط به‌هم ارائه می‌دهد. کروماتوگرام‌های نمایشی از چهار نشانگر STR برای خط سلولی موشی immortalized AML12 که به طور گسترده استفاده می‌شود در شکل 6 نشان داده شده است.

7. تغییرات در خط سلولی و عبور زیاد از مرحله‌های کشت

معمولاً، خطوط سلولی جاودانه‌شده برای نسل‌های بسیاری در آزمایشگاه کشت می‌شوند. با این حال، یک خط سلولی که در تعداد بالای مرحله‌های کشت یا برای مدت طولانی کشت شده باشد، می‌تواند تغییرات کروموزومی، جهش‌ها و تغییرات اپی‌ژنتیک را نشان دهد [71]. این پدیده معمولاً به‌عنوان "انحراف ژنتیکی" شناخته می‌شود. بنابراین، مورفولوژی، سرعت تکثیر، ظرفیت متابولیک یا سلامت عمومی سلول‌ها می‌تواند به‌طور قابل‌توجهی تغییر کند و نتایج آزمایشی را تحت تأثیر قرار دهد [72]. بنابراین، مستندسازی تعداد مرحله‌های کشت سلولی که نشان‌دهنده تعداد دفعاتی است که سلول‌ها به یک ظرف جدید منتقل شده‌اند، هنگام انجام یک آزمایش مهم است.

همچنین گزارش شده است که تعداد مرحله‌های کشت می‌تواند خطر آلودگی ویروسی را افزایش دهد [73]. علاوه بر این، عبور زیاد از مرحله‌های کشت سلول‌ها باعث انتخاب سلول‌های سریع‌تر رشد کننده می‌شود که در برخی موارد نرخ‌های ترشح کمتری دارند، حمل و نقل وابسته به حامل و نفوذ پارا سلولی کاهش می‌یابد، در حالی که نفوذ ترانس سلولی افزایش می‌یابد [74]. بنابراین، تحقیقات مشابه یا حتی یکسان که در آزمایشگاه‌های مختلف انجام می‌شود ممکن است نتایج کاملاً متفاوتی داشته باشد زمانی که تعداد مرحله‌های کشت در آن‌ها به‌طور قابل‌توجهی متفاوت باشد. اگرچه دستورالعمل‌های خاصی در مورد محدوده مرحله‌های کشت بهینه وجود ندارد، عمل معمول این است که از سلول‌ها بعد از 20 تا 30 مرحله کشت استفاده نشود. متاسفانه، دانش دقیق در مورد تعداد مرحله‌های کشت اغلب مشخص نیست، به‌ویژه زمانی که سلول‌ها از منبعی غیر از مخزن‌های سلولی دریافت شده‌اند که معمولاً داده‌هایی در مورد تعداد مرحله‌های کشت سلول‌ها ارائه می‌دهند [75].

در برخی موارد، پژوهشگران استدلال می‌کنند که حتی تعداد مرحله‌های کشت (پاساژ) نیز ممکن است دقیق نباشد، زیرا آزمایشگاه‌های مختلف ممکن است از چگالی‌های مختلف اولیه کاشت سلول‌ها یا نرخ‌های مختلف تقسیم در هنگام پاساژ استفاده کنند که بر تعداد دفعات تقسیم سلول‌ها در کشت‌ها تأثیر می‌گذارد. بنابراین، یک فرمول برای محاسبه دقیق سطح دو برابر شدن جمعیت (PDL)، که مترادف با زمان نسل سلول است، معرفی شد که به‌ویژه برای سلول‌های اولیه استفاده می‌شود. در فرمول مربوطه، PDL که نشان‌دهنده تعداد دفعاتی است که سلول‌ها در جمعیت از زمان جداسازی اولیه خود در آزمایشگاه دو برابر شده‌اند، به‌صورت زیر محاسبه می‌شود:

PDL = 3.32 (log Xe − log Xb) + S

که در آن، Xb تعداد سلول‌های کاشته شده در ابتدای زمان انکوباسیون، Xe تعداد سلول‌ها در انتهای زمان انکوباسیون و S مقدار PDL اولیه قبل از تقسیم است [75,76,77].

8. جنبه‌های ایمنی زیستی در کار با سلول‌ها

کشت‌های سلولی ممکن است قادر به ایجاد آسیب به سلامت انسان و محیط زیست باشند و باید به سطح ایمنی زیستی‌ای اختصاص داده شوند که عوامل مختلفی را در نظر بگیرد [78]. قبل از کار با یک خط سلولی، لازم است که اطلاعات دقیقی در مورد این خطرات به‌دست آید، با توجه به ویژگی‌های ذاتی، نوع دستکاری (ژنتیکی) و خطرات بیولوژیکی ناشی از آن خط سلولی که ممکن است به‌طور قابل‌توجهی توسط پاتوژن‌های آلوده‌کننده افزایش یابد. اگرچه این برآوردها باید به‌صورت موردی انجام شوند، برخی دستورالعمل‌های کلی وجود دارد که باید رعایت شوند.

اولاً، هرچه رابطه ژنتیکی یک سلول مورد بررسی به انسان‌ها نزدیک‌تر باشد، خطر آن برای انسان‌ها بیشتر است، زیرا پاتوژن‌های آلوده‌کننده معمولاً یک سد گونه‌ای خاص دارند. با این حال، باید مراقب بود زیرا برخی از موجودات آلوده‌کننده توانایی عبور از سد گونه‌ای معمول را دارند [79,80,81].

دوم، پتانسیل ایجاد تومور در یک خط سلولی به شدت به منبع آن وابسته است. در حالی که به‌عنوان مثال، سلول‌های اپیتلیالی و فیبروبلاستی پتانسیل کمی برای ایجاد تومور دارند، سلول‌های هماتوپویتیک پتانسیل بسیار بالاتری دارند [82].

سوم، خطوط سلولی خوب شناسایی‌شده که برای سال‌ها در بسیاری از آزمایشگاه‌ها استفاده می‌شوند، خطر کلی کمتری نسبت به خطوط سلولی با رشد مداوم یا سلول‌های اولیه دارند. پس از شناسایی و ارزیابی خطرات احتمالی، ضروری است که روش‌هایی برای اجتناب یا کاهش این خطرات با استفاده از محصورسازی، محدود کردن حرکت کارکنان و تجهیزات به داخل و خارج از آزمایشگاه‌های کشت سلولی، کار مطابق با رویه‌های عملیاتی استاندارد (SOPs)، جلوگیری از تشکیل آئروسل‌ها یا پاشش‌ها هنگام کار، آموزش منظم کشت سلولی و اجرای دستورالعمل‌های کلی رفتارهای خوب آزمایشگاهی (GLP) اتخاذ شود [2,78].

علاوه بر این، واکسیناسیون علیه ویروس هپاتیت B هنگام کار با کشت‌های سلولی انسانی اولیه توصیه می‌شود. با این حال، مقررات جهانی و استانداردهای بین‌المللی ایمنی زیستی و امنیت زیستی معمولاً بین کشورهای مختلف بسیار متغیر هستند و باید قبل از شروع کار مورد توجه قرار گیرند [83].

9. خطوط سلولی مشتق‌شده از بیماران، ارگانوئیدها، مدل‌های زینوگرافت و برنامه‌ریزی مشروط

همانطور که اشاره شد، خطوط سلولی تأسیس‌شده ممکن است پس از گذراندن تعداد زیادی پاساژ دچار انحراف ژنتیکی یا تغییرات فنوتیپی شوند. بنابراین، ممکن است دیگر ویژگی‌های مولکولی که ویژگی‌های اولیه سلول‌ها بودند را به درستی نمایندگی نکنند. به همین دلیل، دانشمندان تکنیک‌هایی را توسعه داده‌اند که اجازه می‌دهند سلول‌های اولیه از بافت یا خون اهداکنندگان سالم یا بیمارانی که از بیماری‌های خاصی رنج می‌برند، تأسیس شوند. برای انسان‌ها، این خطوط سلولی مشتق‌شده از بیماران دارای ارتباط بالینی بالایی هستند [84]. با این حال، جاودانه‌سازی خودبخود یک رویداد نادر است و تأسیس این سلول‌ها اغلب در گذشته با استفاده از تغییرات ویروسی آنکوپروتئین‌ها انجام می‌شد که به‌طور جزئی چرخه سلولی را از کنترل خارج می‌کند یا با استفاده از بیان بیش از حد TERT که بخش‌های کوتاه DNA که در طول تکثیر سلولی از دست می‌روند و در کنترل پیری سلولی دخالت دارند، جایگزین می‌شود [6]. به‌طور مشابه، هدف‌گیری آنکوژن‌ها با استفاده از CRISPR-Cas9 که برای جاودانه‌سازی سلول‌ها در آزمایشگاه استفاده می‌شود، به‌عنوان ابزاری مؤثر برای تأسیس خطوط سلولی جاودانه‌شده شناسایی شده است [7,8].

با این حال، باید به‌طور انتقادی توجه داشت که این دستکاری‌ها می‌توانند تأثیرات ترانسکریپتومی و چرخه سلولی را ایجاد کنند و علاوه بر این، مهار مسیرهای سیگنال‌دهی آسیب DNA توسط عوامل مربوطه منجر به انباشت جهش‌ها می‌شود [85,86]. اخیراً، برنامه‌ریزی مشروط (CR) به‌عنوان ابزاری قدرتمند برای تأسیس کشت‌های طولانی‌مدت سلول‌های اولیه معرفی شده است [86]. تکنیک CR که اولین بار در سال 2012 تأسیس شد، امکان القای تکثیر بی‌پایان سلول‌های اپیتلیالی طبیعی و توموری از بسیاری از بافت‌ها در آزمایشگاه را فراهم می‌آورد. در این تکنیک، سلول‌ها می‌توانند با کشت مشترک با سلول‌های فیبروبلاست‌های تابیده و مهارکننده Rho کیناز Y-27632 به‌طور مشروط برنامه‌ریزی شوند [87]. این فناوری اکنون به‌طور گسترده برای تأسیس کشت‌های سلولی مشتق‌شده از بیماران از سلول‌های طبیعی و بیمار استفاده می‌شود. در این فرایند، سلول‌های اپیتلیالی برای به‌دست آوردن ویژگی‌های سلول‌های بنیادی بالغ با انتقال آن‌ها از محیط کشت استاندارد به محیط CR که وضعیت تمایزی آن‌ها را معکوس می‌کند و امکان تولید تعداد زیادی سلول برای استفاده در مدل‌های مشتق‌شده از بیماران را فراهم می‌کند، بازبرنامه‌ریزی می‌شوند [87]. بنابراین، CR امکانات جالبی را در پزشکی دقیق، پزشکی بازسازی، آزمایش داروها، پروفایل‌سازی بیان ژنی، مطالعات زینوگرافت، و برای تعریف تغییرات ژنتیکی، اپی‌ژنتیکی و متابولیکی که در طول انتقال از فنوتیپ سلول‌های طبیعی به سلول‌های توموری رخ می‌دهد، ارائه می‌دهد [88]. مهم است که پروتکل‌های پیشرفته‌ای در حال حاضر در دسترس است که امکان استفاده از CR را برای گسترش سریع و مؤثر سلول‌های غیر اپیتلیالی شامل سلول‌های عصبی، نورواندوکرین، درون‌ریز و مزانشیمی که به‌طور مشروط برای مدت طولانی رشد می‌کنند، فراهم می‌کند [89].

در پزشکی شخصی، ارگانوئیدها که بافت‌های سه‌بعدی خودسازمان‌دهی‌شده معمولاً از سلول‌های بنیادی جنینی یا بالغ مشتق می‌شوند، توجه زیادی را جلب کرده‌اند [90]. آن‌ها نوعی نسخه مینیاتوری و ساده‌شده از یک ارگان هستند که در یک محیط سه‌بعدی انتخابی که شامل مجموعه‌ای از فاکتورهای رشدی است، شکل می‌گیرند [91]. به‌ویژه، ارگانوئیدهای مشتق‌شده از بیماران (PDOs) در تحقیقات سرطان معرفی شده‌اند. آن‌ها ویژگی‌های پایه‌ای تومورهای اولیه را از جمله پیچیدگی هیستولوژیکی و ویژگی‌های ژنتیکی بازسازی می‌کنند و بنابراین به‌طور ایده‌آل برای پیش‌بینی حساسیت به داروهای ضد تومور یا جنبه‌های پیشرفت تومور مفید هستند [92].

به‌طور مشابه، مدل‌های زینوگرافت مشتق‌شده از بیماران (PDX) موجودات پویایی هستند که می‌توان در آن‌ها تکامل سرطان را به‌طور تجربی نظارت کرد [93]. مدل‌های PDX مدل‌های سرطانی هستند که با کاشت و رشد سلول‌های تومور یک بیمار در یک میزبان حیوانی مناسب تأسیس می‌شوند. در بیشتر موارد، گیرنده یک موش فاقد سیستم ایمنی است که با سیستم ایمنی انسانی پیوند خورده است [94]. این مدل‌ها ابزار تجربی مفیدی برای مطالعه تعاملات مولکولی بین ایمنی انسان و سلول‌های سرطانی شده‌اند.

فرایندها و روش‌های کشت سلولی پایه

فرایندها و روش‌های کشت سلولی بسته به نوع سلول و کاربرد آن متفاوت است. باید به این نکته توجه داشت که اگر سلول‌ها به روش مناسب برای هر فرایند دست‌کاری نشوند، ویژگی‌های آن‌ها ممکن است تغییر کند. این بخش، فرایندها و روش‌های عمومی کشت سلولی را معرفی کرده و نکات مهمی را برای در نظر گرفتن ذکر می‌کند.

آماده‌سازی سلول‌ها برای کشت سلولی

برای به‌دست آوردن سلول‌ها دو روش وجود دارد: از بانک سلولی یا از طریق ایزوله کردن سلول‌ها از بافت اهداکننده. هنگامی که کشت از سلول‌های به‌دست آمده از بانک سلولی شروع می‌شود، باید از مراحل «ذوب»، «کشت سلول‌ها» و «مشاهده سلول‌ها» عبور کرد.

وقتی از بافت جمع‌آوری‌شده از اهداکننده استفاده می‌شود، معمولاً بافت‌های غیرضروری حذف می‌شوند اگر به سلول‌ها متصل باشند. دو روش اصلی برای ایزوله کردن سلول‌ها از بافت وجود دارد: کشت استخراجی و روش آنزیمی. در روش‌های آنزیمی، سلول‌ها از بافت هدف با استفاده از محلول آنزیم پروتئولیتیک ایزوله می‌شوند. اگر از آنزیم استفاده می‌شود، آنزیم باید رقیق شده یا با استفاده از مهارکننده واکنش آنزیم، واکنش آنزیم متوقف شود. سپس مراحل «کشت سلول‌ها» و «مشاهده سلول‌ها» برای آماده‌سازی کشت سلولی ادامه می‌یابد.

ذوب کردن

ذوب سلول‌های منجمد شده (کریوپزشک) برای شروع کشت سلولی را می‌توان به‌عنوان "بیدار کردن سلول‌ها" در نظر گرفت. یک ویال سلول منجمد که از بانک سلولی به‌دست آمده است، از مخزن نیتروژن مایع1 یا فریزر عمیق کریوژنیک (-150 درجه سانتی‌گراد) منتقل می‌شود به یک ظرف ذخیره‌سازی سرد مناسب، مانند ظرف نیتروژن مایع، به میز منتقل شده و در حمام آب 37 درجه سانتی‌گراد یا در دستگاه ذوب2 ذوب می‌شود. قبل از ذوب کامل یخ، سریعاً محیط کشت اضافه می‌شود تا مایع محافظ کریو (مثلاً DMSO) رقیق شود، سلول‌ها با سانتریفیوژ ته‌نشین می‌شوند و پس از حذف سوپرناتانت، محیط تازه‌ای که از قبل به 37 درجه سانتی‌گراد گرم شده است، اضافه می‌شود. سپس سلول‌ها با استفاده از پیپت مجدداً تعلیق می‌شوند و تعداد سلول‌ها/غلظت سلول با استفاده از میکروسکوپ یا شمارشگر سلولی اندازه‌گیری می‌شود.

*1: دو روش برای انجماد و حفظ سلول‌ها در مخزن نیتروژن مایع وجود دارد: «فاز بخار» که در آن از گاز سرد نیتروژن مایع استفاده می‌شود، و «فاز مایع» که در آن شیء منجمد شده مستقیماً در نیتروژن مایع غوطه‌ور می‌شود. در حالت فاز مایع، می‌توان آن را در دمای -196 درجه سانتی‌گراد، دمای نیتروژن مایع، حفظ کرد، اما خطر زیادی برای ورود نیتروژن مایع به ویال منجمد و آلوده کردن آن با باکتری‌ها، مخمرها، مایکوپلاسما و ویروس‌ها از سایر ویال‌ها وجود دارد. بنابراین، ذخیره‌سازی در فاز بخار به شدت توصیه می‌شود. *2: ویال‌هایی که در فاز مایع ذخیره شده‌اند ممکن است در صورت قرار گرفتن در حمام آب 37 درجه سانتی‌گراد یا دستگاه ذوب با نیتروژن مایع باقی‌مانده در ویال منفجر شوند. در این صورت باید درب ویال یک بار شل شده و قبل از قرار دادن آن در حمام آب 37 درجه سانتی‌گراد دوباره سفت شود.

کشت سلول‌ها

برای رسیدن به چگالی هدف کشت سلولی، مقدار محیط تازه مورد نیاز برای دستیابی به چگالی سلولی مورد نظر را بر اساس تعداد سلول‌های اندازه‌گیری شده محاسبه کرده و معلق سلولی را به‌طور مناسب رقیق می‌کنید.

مشاهده سلول‌ها

پس از کشت سلول‌ها در یک ظرف کشت جدید، سلول‌ها را با استفاده از میکروسکوپ نوری یا دستگاه مشاهده دیگر در ظرف مشاهده کنید به‌صورت زیر:

• بررسی کنید که سلول‌ها زنده هستند.

• مطمئن شوید که سلول‌ها به‌طور یکنواخت در ظرف توزیع شده‌اند.

• وجود اشیاء خارجی به غیر از سلول‌ها را بررسی کنید.

• مورفولوژی سلول‌ها را بررسی کنید.

پس از تأیید این موارد، ظرف کشت سلول‌ها را در انکوباتور CO2 با رطوبت 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده و کشت را آغاز کنید.

از آغاز کشت سلولی تا پاساژ

مشاهده سلول‌ها سلول‌ها در یک ظرف کشت جدید کشت می‌شوند که سپس در انکوباتور CO2 قرار می‌گیرد. به طور کلی، در روز بعد*، مشاهدات زیر با استفاده از میکروسکوپ نوری یا دستگاه مشاهده دیگر انجام می‌شود:

• بررسی کنید که هیچ شیء خارجی به غیر از سلول‌ها در ظرف کشت وجود نداشته باشد.

• تعیین کنید که آیا کشت به‌طور طبیعی پیش می‌رود یا خیر، با بررسی مورفولوژی و وضعیت سلول‌ها. *در برخی شرایط، ممکن است سلول‌ها برای دو روز بدون حرکت باقی‌مانده و سپس بررسی شوند، بستگی به شرایط کشت و نوع سلول دارد.

تعویض محیط

پس از اینکه سلول‌ها در ظرف کشت ذوب شده و کشت شدند، شروع به رشد در انکوباتور CO2 می‌کنند. سلول‌ها مواد مغذی موجود در محیط کشت را متابولیزه می‌کنند، بنابراین محیطی که مواد مغذی آن تخلیه شده و با متابولیت‌ها غنی شده باید با محیط تازه تعویض شود. این فرایند به‌عنوان "تعویض محیط" یا "جایگزینی محیط" شناخته می‌شود.

قبل از تعویض محیط، ابتدا سلول‌ها را مشاهده کنید تا تأیید کنید که کشت به‌طور طبیعی پیش می‌رود. پس از حذف محیط قدیمی، سریعاً محیط جدید را اضافه کنید تا از خشکی سلول‌ها جلوگیری شود. برخی سلول‌ها ممکن است در صورت عدم غوطه‌ور شدن در محیط بمیرند، بنابراین در برخی موارد ممکن است مقداری از محیط قدیمی باقی بماند و به‌طور کامل دور ریخته نشود. علاوه بر این، محیط تازه باید به‌طور پیش‌گرم به 37 درجه سانتی‌گراد برسد تا از تغییرات ناگهانی دما برای سلول‌ها جلوگیری شود.

پس از تعویض محیط، سلول‌ها را برای هر گونه نشانه‌ای از آسیب بررسی کنید. از میکروسکوپ برای تصویربرداری از کشت استفاده کنید تا مستند کنید که کشت به‌طور خوب پیش می‌رود، سپس آن را به انکوباتور بازگردانید و از ایجاد مزاحمت‌های غیرضروری خودداری کنید.

پاساژ سلولی

زمانی که سلول‌ها شروع به تکثیر می‌کنند، باید آن‌ها را به ظرف‌های کشت جدید منتقل کرد قبل از اینکه ظرف فعلی پر شود. این فرایند «پاساژ» نامیده می‌شود. وضعیتی که در آن سلول‌ها به اندازه کافی در ظرف کشت رشد کرده‌اند و فضای ظرف را پر کرده‌اند، «کامل شدن» نامیده می‌شود. به طور کلی، توصیه می‌شود که سلول‌ها زمانی پاساژ شوند که مساحت اشغال‌شده توسط سلول‌ها تقریباً 70 تا 80 درصد ظرف را پوشش داده باشد.

زمانی که سلول‌ها کامل می‌شوند، به یکدیگر برخورد می‌کنند و احساس می‌کنند که دیگر نیازی به رشد ندارند، پدیده‌ای که «ممانعت از تماس» نامیده می‌شود. به ویژه در مورد سلول‌های طبیعی، پس از پاساژ، دیگر تکثیر نمی‌کنند. در مورد سلول‌های سرطانی، آن‌ها همچنان به سرعت تکثیر می‌شوند، اما به دلیل کمبود مواد مغذی، بهتر است از کامل شدن آن‌ها جلوگیری شود. به همین دلیل، نظارت و مشاهده رشد سلول‌ها ضروری است.

روش‌های پاساژ بین سلول‌های تعلیق و سلول‌های چسبنده متفاوت است.

پاساژ سلول‌های تعلیقی
کشت سلولی را در یک لوله جمع‌آوری کرده و سپس آن را سانتریفیوژ کنید تا سلول‌ها جمع شوند. سوپرناتانت را حذف کرده و پلیت سلولی را باقی بگذارید و آن را در محیط جدید معلق کنید. قسمتی از سوسپانسیون جدید را با رنگ حیاتی تریپان بلو رنگ‌آمیزی کرده و تعداد سلول‌های زنده را شمارش کنید. غلظت سلولی را محاسبه کرده و روش‌های رقیق‌سازی سلول‌ها را در نظر بگیرید و چگالی سلول‌ها را به‌طور مناسب در سوسپانسیون تنظیم کرده و در ظرف جدید قرار دهید.

پاساژ سلول‌های چسبنده
سلول‌هایی که به سطح ظرف کشت چسبیده‌اند باید به‌گونه‌ای از سطح آن جدا شوند. به طور معمول، از پروتئازهایی مانند کلاژناز، دیسپاز و تریپسین استفاده می‌شود. در مورد تریپسین، فعالیت آن توسط یون‌های کلسیم یا منیزیم مهار می‌شود، بنابراین لازم است که محیطی که حاوی این یون‌ها است قبل از استفاده از آن شسته شود. به‌طور معکوس، کلاژناز و دیسپاز در حضور یون‌های کلسیم فعال می‌شوند.

روش عمومی به شرح زیر است:

حذف سوپرناتانت محیط کشت قدیمی

در صورت لزوم، شستشو با بافر فسفات یا محیط جدید

افزودن محلول آنزیم پراکنده‌سازی سلول

تثبیت در دمای تعیین‌شده در محدوده فعال آنزیم برای مدت زمان تعیین‌شده تا واکنش آنزیمی تحریک شود

بررسی درجه جداسازی سلول‌ها زیر میکروسکوپ

تحریک جداسازی سلول‌ها با اختلال مکانیکی ملایم، مانند ضربه زدن و غیره

اگر محلول توقف برای آنزیم(ها) موجود باشد، آن را برای متوقف کردن واکنش اضافه کنید. در غیر این صورت، محیط تازه اضافه کنید تا آنزیم رقیق شده و فعالیت آن کاهش یابد.

سلول‌ها را با پیپت کردن چندین بار به سوسپانسیون تک‌سلولی تبدیل کنید

محیط همراه با سلول‌ها را جمع‌آوری کرده و سلول‌ها را با سانتریفیوژ ته‌نشین کنید، سپس سوپرناتانت حاوی آنزیم و محلول توقف واکنش را حذف کنید.

لوله را ضربه بزنید تا پلیت سلولی شل شود.

محیط تازه به لوله سلول‌های جمع‌آوری‌شده اضافه کنید.

سلول‌ها را با پیپت کردن بالا و پایین معلق کنید.

نمونه‌ای از سوسپانسیون سلولی به‌عنوان نمونه نماینده برای شمارش تعداد سلول‌ها/چگالی سلول آماده کنید.

تعداد سلول‌ها را با استفاده از میکروسکوپ و هموسایتومتر یا شمارنده سلولی خودکار شمارش کنید.

رقیق‌سازی صحیح برای دستیابی به چگالی سلول مورد نظر را تعیین کرده، مقدار مناسب محیط تازه را اضافه کرده و سلول‌ها را دوباره معلق کنید.

مقدار مشخصی از سوسپانسیون سلولی را در یک ظرف کشت جدید قرار دهید.

مشاهده سلول‌ها با میکروسکوپ

منتقل کردن به انکوباتور CO2 مرطوب‌شده در دمای 37 درجه سانتی‌گراد

با این حال، برخی سلول‌ها ممکن است ضعیف شوند اگر از آنزیم‌های پراکنده‌سازی استفاده شود. در این صورت، می‌توان سلول‌ها را با استفاده از اسکرپر مکانیکی جدا کرد یا با جریان پیپت سلول‌ها را جدا کرده و برداشت کرد.

پردازش پس از کشت سلولی (آماده‌سازی ذخیره‌ها)
ایجاد ذخیره‌هایی که ویژگی‌های مشابه سلول‌های اصلی داشته باشند، اهمیت زیادی دارد، زیرا سلول‌ها مواد زنده هستند و ویژگی‌های آن‌ها ممکن است در طول زمان تغییر کند و اگر پاساژ به مدت طولانی ادامه یابد، ممکن است از سلول‌های اصلی تفاوت پیدا کنند.

برای ایجاد یک ذخیره سلولی می‌توان به شرح زیر عمل کرد:

مشاهده سلول‌ها
مشاهدات زیر را با میکروسکوپ نوری یا دستگاه مشاهده دیگر انجام دهید.

بررسی کنید که هیچ شیء خارجی به غیر از سلول‌ها در ظرف کشت وجود نداشته باشد.

اطمینان حاصل کنید که سلول‌ها هنوز کامل نشده‌اند و بیش از حد تکثیر نکرده‌اند.

با بررسی مورفولوژی و وضعیت سلول‌ها، مطمئن شوید که کشت به‌طور طبیعی پیش می‌رود.

جداسازی سلول‌ها
سلول‌ها را با استفاده از فرایند پاساژ ذکر شده برای ذخیره‌سازی برداشت کنید.

مشاهده سلول‌ها
محیط تازه به سلول‌هایی که با سانتریفیوژ جمع‌آوری شده‌اند اضافه کنید، اما از مقدار کمی محیط استفاده کنید زیرا چگالی سوسپانسیون سلولی باید بیشتر از حالت پاساژ باشد. سلول‌ها با پیپت کردن معلق می‌شوند و تعداد سلول‌ها/چگالی سلول با استفاده از میکروسکوپ یا دستگاه اندازه‌گیری اندازه‌گیری می‌شود.

تقسیم‌بندی
سوسپانسیون سلولی را به تعداد سلول‌های مورد نظر تنظیم کنید، همان مقدار محلول کریوپزشکی 2x غلیظ شده اضافه کنید و دوباره با پیپت کردن معلق کنید. در حالی که پیپت کرده یا هم می‌زنید، مقدار معینی از محلول را در لوله کریو توزیع کنید.

انجماد
لوله کریو باید بلافاصله در یک ظرف فریزر قرار گیرد و در فریزر عمیق (-80 درجه سانتی‌گراد) قرار داده شود تا سرعت انجماد -1 درجه سانتی‌گراد در دقیقه حفظ شود. به‌طور جایگزین، از فریزر کنترل‌شده با نرخ انجماد برنامه‌ریزی‌شده استفاده کنید. پس از انجماد سلول‌ها، لوله‌های کریو منجمد باید در فاز بخار داخل مخزن نیتروژن مایع یا فریزر عمیق کریوژنیک (-150 درجه سانتی‌گراد) ذخیره شوند. اما فرایندها بسته به نوع محلول کریوپزشکی متفاوت است.

تأیید
یک یا دو ویال منجمد شده را ذوب کرده و کشت کنید. بررسی کنید که آیا سلول‌ها می‌توانند به‌طور مشابه رشد کنند و ویژگی‌های تقریباً یکسانی با قبل داشته باشند. پس از تأیید این موضوع، کشت سلولی را متوقف کنید.

شروع آزمایش
ذخیره‌های سلولی آماده‌شده را به‌طور موردی برای فعالیت‌های تحقیقاتی ذوب کنید. پس از مدت زمانی در کشت، سلول‌ها باید دور ریخته شوند و ذخیره جدیدی برای استفاده ذوب گردد.

ایمنی در آزمایشگاه کشت سلول

کاربرد گسترده و هیجان‌انگیز تکنیک‌های کشت سلول در تحقیقات زیست پزشکی، نیازمند توجه ویژه به مدیریت خطرات احتمالی است. این خطرات شامل عوامل عفونی (مانند HBV یا HIV) که ممکن است توسط سلول‌های کشت‌شده نگهداری شوند، و همچنین مواد شیمیایی سمی، خورنده یا جهش‌زا است. این خطرات می‌توانند سلامت کارکنان آزمایشگاه را از طریق تماس پوست و غشاهای مخاطی با مواد جامد، مایعات یا آئروسل‌ها به خطر اندازند و در صورت عدم رعایت نکات ایمنی، محیط زیست را نیز آلوده کنند. بنابراین، قبل از شروع هرگونه فعالیت کشت سلولی، باید اقدامات لازم برای کاهش یا حذف عوامل خطرناک انجام شود تا از بروز عفونت، بیماری‌زایی، واکنش‌های آلرژیک و تماس با سموم جلوگیری شود.

این امر با آموزش دقیق پرسنل آزمایشگاه و اجرای روش‌های استاندارد کشت سلولی، که باید به‌طور منظم توسط اعضای آزمایشگاه و کمیته ایمنی موسسه مورد بازبینی و تجدید نظر قرار گیرد، قابل دستیابی است. علاوه بر این، هنگام کار با سلول‌های اولیه جدا شده مستقیماً از بافت انسان، غربالگری اهداکنندگان برای عوامل بیماری‌زا و واکسیناسیون به‌روز کارکنان آزمایشگاه در برابر بیماری‌های عفونی مانند هپاتیت B ضروری است. در ادامه، دستورالعمل‌های ایمنی کار در آزمایشگاه سلولی ارائه می‌شود.

دستورالعمل‌های ایمنی کار در آزمایشگاه کشت سلول

• هر یک از کارکنان آزمایشگاه مسئول سلامت و ایمنی خود و دیگران است که ممکن است تحت تأثیر کار انجام شده در آزمایشگاه کشت سلولی قرار بگیرند.

• تجهیزات حفاظت فردی (PPE) باید هنگام ورود به آزمایشگاه کشت سلولی پوشیده شوند و هنگام خروج یا آلودگی، از تن خارج شوند. هنگام کار با مواد خطرناک، دستکش‌های آلوده باید بلافاصله تعویض و در ظروف زباله زیست‌خطرناک دفع شوند و دست‌ها فوراً شسته شوند.

• پوشیدن کفش‌های باز، شلوارهای کوتاه و دامن در آزمایشگاه توصیه نمی‌شود.

• مصرف غذا، نوشیدنی، نگهداری مواد غذایی، سیگار کشیدن، استفاده از لوازم آرایشی یا استفاده از لنزهای تماسی در آزمایشگاه کشت سلولی ممنوع است.

• استفاده از تلفن همراه هنگام کار در آزمایشگاه کشت سلولی مجاز نیست.

• لباس‌های گشاد (مانند روسری، گردنبند آویزان) باید قبل از شروع کار برداشته شوند و موها باید به پشت بسته شوند.

• آزمایشگاه کشت سلولی (مانند انکوباتورها، هودهای لامینار و سطوح کار) باید به‌طور منظم با مواد ضدعفونی‌کننده مناسب تمیز شود.

• تمام ابزارهای آزمایشگاهی در تماس با عوامل بالقوه عفونی یا خطرناک باید قبل و بعد از استفاده ضدعفونی شوند. مواد بالقوه عفونی و خطرناک باید طبق دستورالعمل‌های مربوطه ضدعفونی و دفع شوند.

• اقلام تیز (مانند نوک پیپت) باید بلافاصله در ظروف مخصوص دفع شوند.

• قبل از خروج از آزمایشگاه کشت سلولی، دست‌ها باید به‌طور کامل شسته شوند.

• در صورت ریختن عوامل عفونی یا خطرناک، مسئول ایمنی آزمایشگاه باید مطلع شود تا اقدامات لازم برای مهار و سم‌زدایی انجام شود.

مدیریت ایمن رده‌های سلولی

کمیته مشورتی عوامل بیماری‌زای خطرناک (ACDP) که توسط مدیر ایمنی و بهداشت (HSE) اداره می‌شود، توصیه‌هایی را در مورد خطرات ناشی از تماس با عوامل بیماری‌زا برای کارکنان و سایر افراد ارائه می‌دهد. از آنجایی که برخی از رده‌های سلولی بیماری‌زا هستند یا عوامل بیماری‌زا را حمل می‌کنند، تعیین گروه خطر آن‌ها و اتخاذ اقدامات ایمنی مناسب ضروری است. این امر شامل ارزیابی کتبی خطرات و بررسی امکانات آزمایشگاه است.

منابع:
1- https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC10000895/

2-https://www.healthcare.nikon.com/en/ss/cell-image-lab/knowledge/process.html