محیط کشت HAT

محیط کشت Hypoxanthine Aminopterin Thymidine

کشت HAT یکی دیگر از محیط‌های کشت تجاری موجود است که می‌توان آن را در محیط آزمایشگاهی آزمایش کرد و توصیه می‌شود هر محیط را با توجه به ویژگی‌های قابل آزمایش در محیط آزمایشگاه آزمایش کنید. بیش از 1000 محیط رشد مناسب در بازار وجود دارد. شما می توانید اطلاعات جامع تری به دست آورید یا فرهنگ کلاهی نسبت به آمیا حماس داشته باشید.

محیط کشت HAT چیست

محیط کشت HYPOXANTHIN AMINOPTERIN THYMIDINE که به اختصار محیط کشت HAT نیز نامیده می شود، نوعی محیط کشت برای تولید آنتی بادی مونوکلونال است که سلول های میلوما و سلول های طحال را در محیط کشت هیپوگزانتین-آمینوپترین ادغام می کند و هیبریدهای سلولی را انتخاب می کند. محیط مکمل آمینوپترین (HAT) مسدود شده با تیمیدین برای مهار دی هیدروفولات ردوکتاز 3 برای ادامه سنتز DNA استفاده می شود. سلول هایی که نمی توانند از مسیر نجات استفاده کنند برای سنتز نوکلئوتید حذف می شوند. سلول های دارای آنزیم های هیپوگزانتین-گوانین فسفریبوزیل ترانسفراز (HPRTase) و تیمیدین کیناز (TK) در صورت وجود ممکن است از مسیر بهبودی استفاده کنند.

هدف محیط کشت HAT

از محیط HAT برای تهیه آنتی بادی های مونوکلونال استفاده می شود. این فرآیند فناوری هیبریدوما نامیده می شود. حیوانات آزمایشگاهی ابتدا در معرض آنتی ژن مورد نظر برای جداسازی آنتی بادی قرار می گیرند. هنگام جداسازی اسپلنوسیت ها از پستانداران، سلول های B با سلول های میلوم HGPRT منفی که با استفاده از پلی اتیلن گلیکول یا ویروس سندای جاودانه شده اند، ترکیب می شوند. سلول های ذوب شده در محیط HAT کشت می شوند. آمینوپترین موجود در محیط، مسیر de novo را مسدود می کند.بنابراین، سلول‌های میلوما ذوب نشده می‌میرند، زیرا نمی‌توانند نوکلئوتیدها را از طریق مسیر de novo یا نجات بسازند. سلول های B ادغام نشده می میرند زیرا عمر کوتاهی دارند. به این ترتیب، تنها هیبریدهای سلول B-میلوما زنده می مانند. این سلول ها آنتی بادی تولید می کنند (مشخصه سلول های B) و جاودانه هستند (ویژگی سلول های میلوما). سپس محیط کشت را در یک صفحه چند چاهی رقیق کنید تا در هر چاهک فقط یک سلول وجود داشته باشد. سپس آنتی بادی مورد نظر را می توان در مایع رویی هر چاهک تشخیص داد. آنتی بادی های موجود در یک چاه به عنوان آنتی بادی های مونوکلونال شناخته می شوند زیرا اپی توپ یکسانی دارند و توسط سلول های B یکسان تولید می شوند.

فرم محیط کشت HAT

پودر سفید تا مایل به سفید
حلالیت (در 10 میلی لیتر آب)
مایع بی رنگ تا زرد کم رنگ و شفاف
عقیمی
استریل (با تابش گاما)
اندوتوکسین
≤100EU/ml
هر ویال حاوی
هیپوگزانتین: 6.8 میلی گرم آمینوپترین: 0.088 میلی گرم تیمیدین: 1.94 میلی گرم

دستورالعمل های آماده سازی محیط کشت HAT

یک ویال را با 10 میلی لیتر آب استریل ترکیب کنید تا محلول 50X حاوی 0.005 مولار هیپوگزانتین، 0.00005 M آمینوپترین و 0.0008 M تیمیدین تهیه شود. هنگامی که 10 میلی لیتر از کنسانتره 50X با محیط کشت بافت استریل به 500 میلی لیتر رقیق می شود، غلظت نهایی هیپوگزانتین، آمینوپترین و تیمیدین به ترتیب 100 میکرومولار، 0.4 میکرومولار و 16 میکرومولار است.

ذخیره سازی و پایداری

محصولات لیوفیلیزه را قبل از بازسازی در دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری کنید. پودر لیوفیلیزه پس از دریافت به مدت 6 ماه در دمای 20 درجه سانتیگراد پایدار است. پس از بازسازي تا 10 ميلي ليتر، استاك غليظ شده را مي توان در 20- درجه سانتي گراد نگهداري كرد.